miRNA調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用研究

張文明，張媛媛，林燕萍（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122）

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miRNA調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用研究

The effects of imRNA in regulating osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

張文明，張媛媛，林燕萍
（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122）

關(guān)鍵詞成骨分化；miRNA；BMSCs

miRNA是一類(lèi)具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能作用的單鏈小RNA。從1993年在秀麗線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育時(shí)期發(fā)現(xiàn)第一個(gè)miRNA后，miRNA的研究取得巨大突破，目前在多種生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)數(shù)量龐大的miRNA，并且觀察到miRNA具有極其豐富的生物學(xué)功能，對(duì)生物體的發(fā)育代謝凋亡過(guò)程均具有調(diào)控作用。miRNA是一種非編碼的小RNA，長(zhǎng)度約為19～25個(gè)核苷酸，具有高度保守性。大約占到整個(gè)人類(lèi)基因組的1%，調(diào)控人類(lèi)30%以上基因的表達(dá)。參與各種生物體細(xì)胞早期發(fā)育和生長(zhǎng)、增殖、分化、分裂以及凋亡，并且參與重要基因的調(diào)控、體液調(diào)節(jié)、組織重建、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸都具有重要影響［1-3］。其在多種生物體內(nèi)具有高度保守性，在不同的生物體系均起著關(guān)鍵作用，促進(jìn)快速應(yīng)答與機(jī)體生理和結(jié)構(gòu)的精確調(diào)控。它們基于與靶基因的3′非翻譯區(qū)序列互補(bǔ)，從而對(duì)靶基因進(jìn)行降解或抑制，達(dá)到調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)的目的。

1 miRNA的作用機(jī)制

miRNA可通過(guò)兩種不同的機(jī)制來(lái)達(dá)到對(duì)靶基因的調(diào)控：mRNA剪切與翻譯抑制。近期多數(shù)研究均表明，miRNA抑制或沉默靶基因mRNA的方式，決定于其與靶基因3′非翻譯區(qū)序列互補(bǔ)的程度。當(dāng)miRNA與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)序列完全互補(bǔ)時(shí)即可導(dǎo)致mRNA降解，當(dāng)miRNA與靶基因3′非翻譯區(qū)序列不完全互補(bǔ)時(shí)可以導(dǎo)致mRNA抑制，說(shuō)明miRNA與靶基因mRNA相互配對(duì)程度決定了其對(duì)靶基因調(diào)控的方式。由于多數(shù)miRNA與靶基因mRNA完全互補(bǔ)程度并不高，目前發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)靶mRNA的主要作用方式主要是抑制作用。同時(shí)miRNA也可上調(diào)靶基因的表達(dá)，從而對(duì)靶基因起到正性調(diào)控作用。研究表明大約40%～90%編碼蛋白的基因3′非翻譯區(qū)均存在miRNA靶作用點(diǎn)［4］，目前認(rèn)為人類(lèi)基因組中有1 048條miRNA［5］，而人類(lèi)30%～40%的基因在翻譯水平受miRNA的調(diào)控［6］。單個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因mRNA，單個(gè)基因也可以被多個(gè)miRNA調(diào)控［7］。

miRNA的靶mRNA主要是細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)因子、生長(zhǎng)因子等，研究miRNA的功能主要通過(guò)研究其與靶基因的關(guān)系，其作用機(jī)制為miRNA 5′端的種子區(qū)與其靶基因3′UTR區(qū)結(jié)合，說(shuō)明只要找到細(xì)胞中miRNA的靶mRNA，就可以研究細(xì)胞中該miRNA的作用，靶基因的確定至關(guān)重要。由于miRNA及其靶基因mRNA序列在物種間具有高度保守性，這為miRNA的預(yù)測(cè)奠定了基礎(chǔ)。目前研究miRNA-靶mRNA之間相互作用的方法包括：靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、構(gòu)建載體上調(diào)miRNA的表達(dá)和下調(diào)miRNA的表達(dá)檢測(cè)目標(biāo)mRNA。其中利用表達(dá)譜分析和生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)靶基因?yàn)閙iRNA功能研究提供大量線(xiàn)索。利用生物信息學(xué)技術(shù)用計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)靶mRNA后，還需通過(guò)蛋白基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證靶基因的可靠性。根據(jù)miRNA調(diào)控機(jī)制的不同，實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證分為兩個(gè)方面：通過(guò)對(duì)降解產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄和克隆測(cè)序可以完成對(duì)靶基因mRNA降解作用的驗(yàn)證。對(duì)于翻譯抑制機(jī)制，需要采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，構(gòu)建載體上調(diào)和下調(diào)miRNA對(duì)靶mRNA進(jìn)行雙熒光驗(yàn)證、蛋白組學(xué)分析。

2 miRNA調(diào)控BMSCs成骨分化

成骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）［8］，即決定骨形成的成骨細(xì)胞由BMSCs分化成熟而來(lái)，BMSCs的數(shù)量和成骨分化功能直接影響成骨細(xì)胞的數(shù)量和功能活性，因此BMSCs向成骨細(xì)胞分化對(duì)維持骨穩(wěn)態(tài)非常重要。那么miRNA在BMSCs向成骨細(xì)胞分化中有何作用呢？2008年，Kobayashis發(fā)現(xiàn)在敲除了小鼠的內(nèi)切核酸酶Dicer后，小鼠BMSCs成骨分化功能消失［9］。小鼠軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，軟骨生成減少，密度下降。Dicer是miRNA合成所必需的一個(gè)內(nèi)切酶，說(shuō)明miRNA在骨形成和發(fā)育中有重要作用［10］。BMSCs的增殖活性與成骨分化過(guò)程均與miRNA密切相關(guān)。BMSCs成骨分化過(guò)程涉及多條信號(hào)通路，如BMP信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、TGF-β通路、Notch信號(hào)通路等［11］。一般來(lái)說(shuō)miRNA對(duì)基因進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，因此miRNA對(duì)成骨分化的作用可以是作用于促進(jìn)成骨的基因而抑制成骨，也可以是作用于抑制成骨作用的基因，從而間接地對(duì)成骨進(jìn)行正性調(diào)控［12］。

2.1促進(jìn)成骨分化的miRNA

Li Z等［13］發(fā)現(xiàn)在MC3T3細(xì)胞成骨分化過(guò)程中，miR-29b可以通過(guò)作用于抑制成骨的靶基因HDAC4、TGF-β3、ACVR2A，通過(guò)降解作用，阻止其表達(dá)，從而促進(jìn)成骨。此外還有研究發(fā)現(xiàn)miR-29a通過(guò)抑制DKK1來(lái)激活WNT通路，通過(guò)與WNT通路形成循環(huán)來(lái)促進(jìn)成骨分化［14］。同樣，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-27可以抑制靶基因APC，從而反激活WNT促進(jìn)成骨分化［15］。Liu Y等［16］認(rèn)為miR-17可能通過(guò)抑制牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的負(fù)性調(diào)控因子Smurf1，從而促進(jìn)牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。He J等［17］發(fā)現(xiàn)miR-20b通過(guò)與其靶基因PPARγ結(jié)合，降低PPARγ的表達(dá)，從而提高了成骨核心轉(zhuǎn)錄因子Runx2轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)成骨分化。該研究認(rèn)為PPARγ通過(guò)促進(jìn)成酯分化，抑制成骨分化的轉(zhuǎn)錄因子。Zhou Q等［18］用伊班磷酸鈉干預(yù)牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，miR-18及相關(guān)成骨轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上升，表明miR-18可能在伊班磷酸鈉促進(jìn)牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中起到正性調(diào)控作用。miR-210在ST2成骨分化過(guò)程中可能通過(guò)沉默抑制成骨分化的重要基因AcvR1b來(lái)促進(jìn)成骨，過(guò)表達(dá)miR-210后堿性磷酸酶、成骨核心結(jié)合因子Runx2的表達(dá)上升［19］。

2.2抑制成骨分化的miRNA

Wei J等［20］發(fā)現(xiàn)，miR-34b和miR-34c作為miR-34家族的2個(gè)成員通過(guò)兩條途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制成骨的作用，一方面CDK4、CDK6和CyclinD1蛋白積累等被miR-34b和miR-34c所阻礙，從而抑制了成骨細(xì)胞的數(shù)量；另一方面SATB2蛋白的表達(dá)降低從而抑制成骨細(xì)胞的分化。Li Z等［21］發(fā)現(xiàn)在BMP2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞成骨分化中，對(duì)其中顯著下調(diào)的miR-133和miR-135進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，miR-133的靶基因?yàn)镽unx2，而miR-135的靶基因?yàn)镾mad5，兩者共同作用來(lái)抑制骨的形成。那么在臨床上可以通過(guò)降低miR-133和miR-135的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨作用，最終達(dá)到改善骨重建的作用。Wang X等［22］研究發(fā)現(xiàn)老年骨折患者的骨組織中高表達(dá)miR-214，miR-214是通過(guò)作用于活化轉(zhuǎn)錄因子4ATF4來(lái)降低成骨作用的。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中miR-214也被證實(shí)具有抑制成骨細(xì)胞活性的作用。Eskildscn T等［23］發(fā)現(xiàn)miR-138可以直接作用于成簇黏附激酶FAK，抑制FAK-ERK1/2信號(hào)通路，從而降低下游成骨核心結(jié)合因子Runx2和OSX的表達(dá)來(lái)降低成骨作用。同樣，在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-138后骨形成下降，低表達(dá)miR-138后成骨作用增加。Zeng Y等［24］發(fā)現(xiàn)miR-100抑制干細(xì)胞成骨分化，該作用通過(guò)降低骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體BMP-2來(lái)實(shí)現(xiàn)。Gao J［25］分離培養(yǎng)人的BMSCs后在成骨分化過(guò)程中篩選分化前后miRNA差異最大的hsa-miR-31、hsa-miR-106a、hsa-miR-148a，并且發(fā)現(xiàn)這些miRNA可能通過(guò)成骨核心結(jié)合因子Runx2、CBFB和BMPs起作用。Schaap-Oziemlak A M等［26］發(fā)現(xiàn)hsa-miR-135b可能作用于IBPS和Osterix，在無(wú)限成體干細(xì)胞（USSCs）中顯著下調(diào)。同樣miR-637在間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中表達(dá)也降低，可能也是通過(guò)靶基因Osterix起作用的。

3展　望

研究證實(shí)miRNA幾乎參與了生物學(xué)行為中所有的基因調(diào)控通路，具有極強(qiáng)的調(diào)控作用。miRNA對(duì)干細(xì)胞自我更新和分化調(diào)控機(jī)制是必須要明確的，也是目前科學(xué)家正在努力研究的熱點(diǎn)課題。生物，包括人類(lèi)，在對(duì)環(huán)境適應(yīng)及進(jìn)化過(guò)程中伴隨著頻繁而持續(xù)的基因—基因和基因—環(huán)境相互作用，miRNA的高度保守性決定了其非常適合研究基因—基因和基因—環(huán)境相互作用。針對(duì)某種特殊疾病的病理，可能對(duì)某些特定表型具有陽(yáng)性或陰性效應(yīng)的miRNA基因，用生理及遺傳病理模型評(píng)估陽(yáng)性miRNA與蛋白編碼基因潛在作用靶點(diǎn)的關(guān)系，從而用于疾病的診斷與治療，可能將成為未來(lái)基因與疾病研究的熱點(diǎn)，miRNA基因效應(yīng)的分子生理學(xué)認(rèn)識(shí)可能會(huì)帶來(lái)直達(dá)作用靶點(diǎn)的治療。

在一些增齡性疾病如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）的研究中，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及基因芯片的篩選，發(fā)現(xiàn)某些特定的miRNA可能控制著B(niǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化，這些miRNA通過(guò)降低或提高成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子來(lái)抑制或促進(jìn)BMSCs的成骨分化過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，某些miRNA調(diào)控作用具有高度保守性，在進(jìn)化過(guò)程中以及不同物種間還保持完整的作用?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)絕經(jīng)前后患者骨組織或血液、體液中的特異基因miRNA，由此來(lái)進(jìn)行PMOP的診斷。而進(jìn)一步發(fā)展和調(diào)整miRNA干擾載體，使它能在BMSCs成骨分化中起到促進(jìn)成骨作用，從而預(yù)防和治療PMOP，這將是一種全新的PMOP診治模式。但成骨過(guò)程中有多少特異性miRNA參與對(duì)BMSCs生物學(xué)行為調(diào)控?這些特異性miRNA又如何調(diào)控促進(jìn)代謝性骨病的發(fā)生？能否通過(guò)降低或提高特異性miRNA改變BMSCs的生物學(xué)特性？有待于我們進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］Cheng A M，Byrom M W，Shelton J，et al. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cellgrowth and apoptosis［J］. Nucleic Acids Res，2005，33（4）：1 290-1 297.

［2］Bushati N，Cohen S M. MicroRNA functions［J］. Annu Rev Cell Dev Biol，2007（23）：175-205.

［3］Gangaraju V K，Lin H. MicroRNAs：key regulators of stem cells［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（2）：116-125.

［4］Hu R，Li H，Liu W，et al. Targeting miRNAs in osteoblast differentiation and bone formation［J］. Expert Opin Targets，2010，14（10）：1 109-1 120.

［5］Davis B N，Hata A. Regulation of MicroRNA biogenesis：A miRiad of mechanisms［J］. Cell Commun Signal，2009，7（83）：18.

［6］Selbach M，Schwanhausser B，Thierfelder N，et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs［J］. Nature，2008，455（7 209）：58-63.

［7］Ambros V. The functions of animal microRNAs［J］. Nature，2004，431（7 006）：350-355.

［8］Long F. Building strong bones molecular regulation of the osteoblast lineage［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13（1）：27-38.

［9］Oskowitz A Z，Lu J，Penfornis P，et al. Human multipotent stromal cells from bone marrow and microRNA：regulation of differentiation and leukemia inhibitory factor expression［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（47）：18 372-18 377.

［10］Harfe B D，Mcmanus M T，Mansfield J H，et al. The RNasellI enzyme Dicer is required for morphogenesis but not patterning of the vertebrate limb［J］. Proc Nat1 Acad Sci USA，2005，102（31）：10 898-10 903.

［11］Augello A，De Bari C. The regulation of differentiation in mesenchymal stem cells［J］. Hungene Ther，2010，21（10）：1 226-2 238.

［12］Blakaj A，Lin H. Piecing together the mosaic of early mammalian development through microRNAs［J］. J Biol Chem，283（15）：9 505-9 508.

［13］Li Z，Hassan M Q，Jafferji M，et al. Biological functions of miR-29b contribute to positive regulation of osteoblast differentiation［J］. J Biol Chem，2009，284（23）：15 676-15 684.

［14］Kapinas K，Kessler C，Ricks T，et al. miR-29 modulates WNT signaling in human osteoblasts through a positive feedback loop［J］. J Biol Chem，285 （33）：25 221-25 231.

［15］Wang L L，Huang Y，Wangg，et al. The potential role of microRNA-146 in Alzheimer′s disease：biomarker or therapeutic target?［J］. Med Hypotheses，78（3）：398-401.

［16］Liu Y，Liu W，Hu C，et al. MiR-17 modulates osteogenic differentiation through a coherent feed forward loop in mesenchymal stem cells isolated from periodontal ligaments of patients with periodontitis［J］. Stem Cells，2011，29（11）：1 804-1816.

［17］He J，Zhang J F，Yi C，et al. miRNA-mediated functional changes through co-regulating function relatedgenes［J］. Plos One，2010，5（10）：e13558.

［18］Zhou Q，Zhao Z N，Cheng J T，et al. Ibandronate promotes osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells by regulating the expression of microRNAs［J］. Biochem Biophys Res Commun，2011，404（1）：127-132.

［19］Mizuno Y，Tokuzawa Y，Ninomiya Y，et al. miR-210 promotes osteoblastic differentiation through inhibition of AcvR1b［J］. Febs Lett，2009，583（13）：2 263-2 268.

［20］Wei J，Shi Y，Zheng L，et al. miR-34s inhibit osteoblast proliferation and differentiation in the mouse by targeting SATB2［J］. J Cell Biol，2012，197 （4）：509-521.

［21］Li Z，Hassan M Q，Volinia S，et al. A microRNA signature for a BMP2-induced osteoblast lineage commitment program［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（37）：13 906-13 911.

［22］Wang X，Guo B，Li Q，et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation［J］. Nat Med，2013，19（1）：93-100.

［23］Eskildscn T，Taipalccnmaki H，Stcnvang J，et al. MicroRNA-138 regulates osteogenic differentiation of human stromal（mesenchymal）stem cells in vivo［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（15）：6 139-6 144.

［24］Zeng Y，Qu X，Li H，et al. MicroRNA-100 regulates osteogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells by targeting BMPR2［J］. Febs Lett，2012，586（16）：2 375-2 381.

［25］Gao J，Yang T，Han J，et al. MicroRNA expression during osteogenic differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells from bone marrow［J］. J Cell Biochem，2011，112（7）：1 844-1 856.

［26］Schaap-Oziemlak A M，Raymakers R A，Bergevoet S M，et al. MicroRNA hsa-miR-135b regulates mineralization in osteogenic differentiation of human unrestricted somatic stem cell［J］. Stem Cell Dev，2010，19（6）：877-885.

（編輯：梁葆朱）

中圖分類(lèi)號(hào)：Q522

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-0258（2016）02-0060-03

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173282）

［作者簡(jiǎn)介］張文明，在讀博士，E-mail：393390125@qq.com

［通訊作者］林燕萍，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：lyp66@126.com