中藥砷劑活性代謝產物單甲基亞砷酸的生物學效應研究進展

Process in biological effects of bioactive metabolite（monomethylarsonous acid）produced by arsenic trioxide

鄒建華1，付　娟1，陳　喆2（1.浙江中醫藥大學，浙江杭州310053；2.浙江省中醫院，浙江杭州310006）

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中藥砷劑活性代謝產物單甲基亞砷酸的生物學效應研究進展

Process in biological effects of bioactive metabolite（monomethylarsonous acid）produced by arsenic trioxide

鄒建華1，付娟1，陳喆2
（1.浙江中醫藥大學，浙江杭州310053；2.浙江省中醫院，浙江杭州310006）

關鍵詞三氧化二砷；單甲基亞砷酸；生物學效應；研究進展

三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）俗稱砒霜，始載于宋《開寶本草》，其味苦酸，有毒，歸脾、肺、肝經，具有蝕瘡、去腐、殺蟲、劫痰定喘、劫瘧之功。砷是一種廣泛存在于人類生活環境中的致癌物質［1］，與包括皮膚癌、肺癌和膀胱癌在內的多種惡性腫瘤相關。近年來，As2O3被成功應用于治療急性早幼粒細胞性白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）［2］。此外，砷可以誘導多種惡性腫瘤細胞凋亡。單甲基亞砷酸（MMAIII）是As2O3甲基化的活性代謝產物，大量研究表明MMAIII具有比As2O3更強的生物學活性［3-4］。低劑量短期作用表現明顯的抗腫瘤作用，長期慢性暴露在MMAIII下導致細胞惡性轉化。現通過檢索國內外相關文獻，綜述As2O3代謝產物MMAIII的急性和慢性生物學效應。

1三氧化二砷體內代謝過程

砷是一種廣泛存在于人類生活環境中的致癌物質。近年研究發現As2O3在體內代謝有兩個關鍵過程：①五價砷被還原。五價砷被還原為三價狀態，主要通過砷酸鹽還原酶催化的酶促反應和谷胱甘肽催化的非酶促反應兩種途徑完成。②三價砷的甲基化。被還原為三價狀態的砷在肝臟甲基轉移酶的催化下生成單甲基砷酸（MMAV），在MMAV還原酶的作用下MMAV被還原為單甲基亞砷酸（MMAIII），MMAIII可以進一步被甲基化為二甲基亞砷酸（DMAIII）。在上述過程中，谷胱甘肽（GSH）和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）發揮了重要的作用［5-6］。

2 MMAIII的急性生物學效應

2.1 MMAIII誘導內質網應激介導的腫瘤細胞凋亡

內質網應激（ERS）在細胞凋亡、生存、增殖和分化中發揮了重要的調控作用［7］。PERK是內質網上的一種跨膜蛋白，當ERS發生時PERK自身磷酸化為PPERK而被激活，進而通過級聯反應激活轉錄因子4 （activating transcription factor-4，ATF4）及下游重要的凋亡啟動蛋白CHOP的表達，誘導細胞凋亡［8-9］。有研究發現15 μM隱丹參酮（CPT）分別聯合1 μM MMAIII和1 μM As2O3協同作用乳腺癌MCF-7細胞，24 h后MTT法檢測發現MMAIII聯合CPT協同抗乳腺癌MCF-7細胞效果明顯優于As2O3聯合CPT。Western blot檢測MMAIII聯合CPT協同作用1 h后P-PERK蛋白表達顯著增高，并且呈時間依賴性促進下游蛋白ATF4及CHOP的表達，進而誘導促凋亡蛋白Bax、Bak的活化和細胞色素C的釋放，引起MCF-7細胞凋亡［10］。

2.2 MMAIII通過泛素化蛋白酶系統誘導P53蛋白降解引起細胞凋亡

P53是一種重要的抑癌基因，其編碼產物參與細胞周期調控［11-12］。大量研究表明，被泛素化的P53蛋白最終在細胞質內通過Mdm2泛素化蛋白酶系統降解，進而發揮對細胞周期的調控作用［12-16］。槲皮素聯合MMAIII作用正常角質HaCaT細胞后通過誘導P53蛋白泛素化促進HaCaT細胞凋亡發生［17］。

2.3 MMAIII通過抑制線粒體功能誘導細胞凋亡

大量文獻報道線粒體在凋亡的早期即出現結構與功能的變化，包括通透性轉運孔（permeability transition pore，PTP）的開放和跨膜電位（mitochondrial transmembrane potential，MTP）的耗散。另有研究表明MMAIII影響線粒體通透性轉換孔的功能促進線粒體內膜的Ca2+內流，引起線粒體腫脹、細胞色素C釋放，誘導細胞凋亡發生［18］。已有研究報道，MMAIII抑制大鼠肝臟RLC16細胞線粒體呼吸鏈復合物II和IV的活性，誘導活性氧（ROS）的產生，促進細胞凋亡［19］。

2.4 MMAIII增強血管收縮引起血壓升高

高血壓與中風、缺血性心臟病、動脈粥樣硬化等疾病的發生發展密切相關，大量流行病學證據表明，砷暴露與高血壓在內的多種心血管系統疾病密切相關。Lim K M等［20］將新鮮分離的大鼠主動脈環暴露于MMAIII（＜0.5 μM）發現可以增強激動劑誘導的血管收縮和升壓反應，Western blot檢測發現MMAIII呈時間和濃度依賴性促進苯腎上腺素（phenylephrine，PE）對RhoA的活化，進而說明MMAIII增強血管收縮引起高血壓與RhoA的激活密切相關。

2.5 MMAIII誘導血小板凋亡，促進血栓形成

磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）暴露在細胞外膜是激活凝血的重要過程，也被認為是細胞凋亡的標記之一［21］。Bae O N等［22］利用50 μM MMAIII作用人血小板1 h后發現PS外翻增加，線粒體膜電位改變，凋亡蛋白表達增多。上述過程中PS外翻與蛋白質的巰基和細胞內ATP水平下降有關，加入NAC和L-半胱氨酸等巰基化合物后可以明顯逆轉上述反應。這意味著蛋白質的巰基和ATP的耗竭可能有助于MMAIII誘導PS外翻，誘導血小板凋亡，促進血栓形成。

2.6 MMAIII抑制T細胞的增殖影響免疫系統的功能

體內外實驗研究證明,環境中的亞砷酸鹽會影響免疫功能，砷通過飲用水暴露在人群中，對人體T細胞免疫功能產生影響，而免疫抑制與感染、癌癥和其他疾病的發生發展密切相關。Burchiel S W等［23］將30個正常捐贈者血液中的T細胞暴露于1 nM～100 nM的MMAIII和NaAsO254 h后發現100 nM的NaAsO2對大多數捐贈者的T細胞沒有明顯的增殖抑制作用，但是100 nM MMAIII能明顯抑制所有捐贈者T細胞的增殖，進而影響捐贈者的免疫功能。

2.7 MMAIII急性暴露后抑制膽固醇的合成

膽固醇是人類細胞膜的重要組成部分，膽固醇合成不足可以影響細胞膜的穩定性。Guo L等［24］利用定量蛋白質組學檢測MMAIII作用人類皮膚成纖維細胞GM00637后蛋白組學的變化情況，發現MMAIII可以下調膽固醇合成酶，使內源性膽固醇的合成減少。

3 MMAIII的慢性生物學效應

3.1 MMAIII長期暴露活化COX-2，促進膀胱細胞惡性轉變

COX-2是負責類花生酸合成的誘導酶，在促進細胞增殖、抑制細胞死亡、誘導血管生成和促進轉移侵襲中發揮調控［25-26］。Src、PI3K、COX-1、COX-2信號通路與MMAIII誘導的UROtsa細胞非貼壁性生長密切相關。提示COX-2或COX-2介導的信號轉導通路在MMAIII誘導膀胱上皮細胞惡性轉化中發揮重要作用。

3.2 MMAIII長期暴露促進炎癥相關因子釋放，引起炎癥反應

炎癥反應常被認為是一種對機體有害的生物學現象［27］，Virchow最初觀察到被特定化學刺激物引發的組織炎癥與細胞增生程度增強有關，提出慢性炎癥與癌變之間存在關聯［28］。細胞壞死時細胞膜破裂，細胞質釋放到鄰近細胞引起炎癥反應。大量文獻表明，MMAIII可以促進多種炎癥因子的釋放，進而激活細胞內多種信號通路，促進腫瘤的發生發展。有研究報道50 nM MMAIII作用于UROtsa細胞3個月后可以刺激TNFα、IL-6、IL-8等炎癥因子的釋放，引起炎癥反應［29］。UROtsa細胞長期暴露在MMAIII中發現炎癥相關因子（IL-1β，IL-6 and IL-8）分泌增多，其中IL-8尤為明顯。IL-8可以進一步激活NFKβ、AP1/cjun、ERK2、STAT3等炎癥相關基因表達上調，基因沉默IL-8后可以逆轉該現象［30］。上述結果表明IL-8介導了MMAIII促進UROtsa細胞惡性轉化。

3.3 MMAIII長期暴露后影響DNA修復功能

細胞的惡性變與DNA的損傷有著密切的關系，DNA損傷修復有多種酶參與，PARP-1是參與DNA堿基切除修復啟動的關鍵酶。Wnek S M等［31］發現MMAIII連續處理UROtsa細胞8 w、12 w后可顯著增加DNA單鏈的斷裂，斷裂的DNA可以迅速激活PARP-1，PARP-1的修復作用主要依賴于其N末端與DNA結合區域的兩個鋅指結構。MMAIII可以競爭性與兩個鋅指結構結合，從而抑制PARP-1蛋白功能，引起DNA損傷，促進UROtsa細胞惡性轉化。

4問題與展望

目前，小分子藥物靶點的發現對于生物和醫學具有重大意義，研究小分子化合物與蛋白質分子間的相互作用已成為熱點。MMAIII作為As2O3的小分子甲基化代謝產物，具有比As2O3更強的生物學效應，但其分子學作用機制仍不明確。大量體外實驗表明MMAIII抗腫瘤效果明顯優于As2O3，且其毒副反應更小。盡管As2O3成功用于臨床治療APL等多種惡性腫瘤，但MMAIII的臨床應用文獻報道甚少。闡明MMAIII分子作用機制為中藥砷劑的深入研究，指導臨床治療用藥是我們目前亟待解決的問題。隨著對中藥砷劑研究的不斷深入，人們對其活性代謝產物MMAIII的認識不斷加深，這為其臨床應用和新藥開發提供了理論依據，MMAIII具有廣闊的臨床應用前景。

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（編輯：張世霞）

中圖分類號：R282.76

文獻標識碼：A

文章編號：1671-0258（2016）02-0073-03

［基金項目］國家自然科學基金（81473389）

［作者簡介］鄒建華，在讀碩士，E-mail：2836088573@qq.com

［通訊作者］陳喆，副研究員，研究生導師，E-mail：alexisczh@sohu.com