慢性乙型肝炎后肝硬化證候的生物物質基礎研究進展＊

劉亞敏，石玉琳，陳 健，湯琛琛，蘇式兵，陳啟龍

（上海中醫藥大學中醫復雜系統研究中心 上海 201203）

慢性乙型肝炎后肝硬化證候的生物物質基礎研究進展＊

劉亞敏，石玉琳，陳 健，湯琛琛，蘇式兵，陳啟龍＊＊

（上海中醫藥大學中醫復雜系統研究中心 上海 201203）

慢性乙型肝炎（乙肝）后肝硬化是慢性乙型肝炎進展至終末期的常見表現，臨床治療一直收效甚微。中醫辨證治療乙肝后肝硬化具有獨特作用。近年來，中醫藥在臨床辨證及對證治療慢性病已經有了大量的探索，但復雜的“病”、“證”關系依然制約了中醫藥治療乙肝后肝硬化的發展。本文從乙肝后肝硬化病證機制出發，分別從基因、蛋白、代謝及表觀遺傳學水平闡述了乙肝后肝硬化“病”的分子機制及“證”的生物物質基礎。并展望了基于病證結合的中醫精準醫療在乙肝后肝硬化個性化治療上的應用前景，以期為乙肝后肝硬化中醫精確治療的發展提供參考。

中醫藥 乙肝后肝硬化 病與證 生物物質基礎

慢性乙型肝炎（慢乙肝）后肝硬化（Hepatitis B-Caused Cirrhosis，HBC）是由乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）引起的慢性、進行性、彌漫性肝纖維化以及假小葉的形成為特點的慢性疾病。中國的HBV感染及慢乙肝患者眾多，其中有超過30%的患者在未來15年內會發展成肝硬化[1]。在乙肝肝硬化的失代償期，會出現腹水、門靜脈高壓及肝性腦病、上消化道出血等并發癥，嚴重危害患者的生命安全，每年死亡人數可高達100萬[2]。由于乙肝后肝硬化的分子機制十分復雜，臨床治療依然面臨諸多困難，而中醫辨證治療認為是乙肝后肝硬化治療的一種獨特方法。一般而言，中醫治療會根據患者體質、發病原因、具體表象以及病程進展等進行綜合判斷、辨證施治[3，4]。然而，由于現今符合中醫藥特點的療效評價方法及其體系還不夠完善，導致中醫治療乙肝后肝硬化的臨床效價難以體現[5]，究其原因是因為乙肝后肝硬化在中醫證型間的動態變化[6，7]及病證關系機制還有待深入研究。

1 病、證的一般內涵

病與證是相互聯系的，但二者又具有不同的內涵。病以病理學內容為核心，具有一定發展規律且表現出若干特定癥狀的演變過程；證以病機為核心，是對疾病所處一定階段的病因、性質、位置等所做的概括[8]。辨病即是從微觀角度出發，借助實驗手段來認識疾病的全過程，探求致病因子作用于不同機體表現出來的共同病理變化[9]；而辨證是從宏觀角度，注重根據病情某一發展階段的病理特點而做出階段性的判斷[10]。此外，疾病在不同時點、階段可表現為不同的證候，體現出一定的證候演變[11]。因此，疾病是決定證候的內在穩定的因素，證候是疾病的外在綜合表現[12]。從疾病發展時間上看，病包含多個證，體現了其動態變化的過程。在空間上，疾病發生又可表現為一證包含多病的情況[13]。病與證具有一定的時空效應，反映出病、證在時間與空間上復雜的交叉網絡關系。

2 乙肝后肝硬化的“病”與“證”

目前，乙肝后肝硬化“病”、“證”的內在關聯研究依然面臨諸多困難。主要體現在微觀的生物學指標與宏觀的證候表型之間關系錯綜復雜，缺乏一個闡釋證候內在整體性的研究方法[14]。因此，乙肝后肝硬化“病”的分子機制及“證”的分型與演化就成為系統闡述乙肝后肝硬化中醫病證關系機制的重要切入口。

2.1 乙肝后肝硬化“病”的分子機制

2.1.1 基因水平

在乙肝后肝硬化“病”的動態變化中，發現CASP1、TGF-β1、IFI30、HLA-DMA、PAG1可能是慢乙肝-肝硬化過程的重要分子標志物[15]。Liu N等[16]證實，HBV可以通過下調miR-15a的表達導致SMAD7的水平上升，而SMAD7的高表達又會抑制TGF-β1引起的細胞凋亡，促發肝臟纖維化甚至腫瘤的發生。Luo S M等[17]通過對比不同基因的表達量發現，IGF1和IGFBP3基因表達失衡可能是影響乙肝后肝硬化預后的重要因素。在肝硬化病人血清及外周血單核細胞中，IL17基因的表達水平升高，提示IL17不僅是導致炎癥發生的重要基因，還可能是肝硬化惡化的重要因素之一[18]。Cheong J Y等[19]發現，miR-604的rs2368392 CC基因型多見于慢乙肝、肝硬化及肝癌患者中，有趣的是，miR-604的T等位基因雖然是慢乙肝的易感基因，但卻是阻止慢乙肝向肝硬化、肝癌發展的保護型基因。郭琳瑯[20]發現，凋亡基因BAX和FAS過表達可能參與乙肝病毒致肝細胞損傷過程，通過引起感染細胞的凋亡而導致肝組織損傷。同時，在NF-κB和TGF-β信號通路中，上調miR-29的表達能夠抑制肝星狀細胞中膠原的分泌，從而延緩肝炎患者進展成肝硬化[21，22]。而miR-222/miR-221的上調表達可激活肝星狀細胞膠原的分泌[23]，加速了患者肝纖維化及肝硬化的進程。此外，miR-181b、miR-214-5p、miR-133a、miR-199等也認為可能是乙肝后肝硬化發展過程中的生物標志物[24]，其具體作用機制還有待于進一步探索。

2.1.2 蛋白質水平

研究證明，慢性肝病患者持續的HBV復制和表達可觸發內質網應激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）[25]，而ERS可以上調MANF基因的表達及其編碼蛋白的分泌。潘高峰等[26]對不同炎癥和纖維化分級的肝臟穿刺組織進行ITRAQ蛋白質組學研究，發現MANF蛋白隨著炎癥和纖維化的加重而表達逐步增加。張超等[27]運用免疫組化法檢測GRIM-19蛋白在不同組織中的表達水平，發現該蛋白在乙肝后肝硬化組織中的表達水平明顯高于肝癌組織、癌旁組織以及正常肝組織。之前也有文獻報道GRIM-19在一些癌組織中的表達顯著降低或缺失，這可能是肝細胞發生癌變后啟動了抗凋亡因子抑制GRIM-19表達[28，29]。因此，GRIM-19在肝硬化組織表達量一旦降低，則可能是肝細胞發生癌變的一個重要判斷指標。盧小玲等[30]發現DNA損傷修復基因所編碼的ERCC1蛋白會隨著HBV-DNA的復制活躍而降低，并且其表達是隨著乙肝患者的炎癥程度及纖維化程度的加重而呈現出一種先升高后降低的趨勢，提示ERCC1蛋白與慢乙肝和肝硬化的演變可能存在一定關系。此外，作為TLR3信號通路中重要的銜接蛋白TRIF常常會被感染的HBV所劫持而發展為免疫逃逸[31]。換而言之，通過人為上調肝細胞內TRIF蛋白的表達，促進了NF-κB、ISRE和IFN-β基因啟動子的活化，誘導了具有抗病毒作用的炎癥因子、ISGs和IFN-β的表達，有助于肝細胞內抗病毒狀態的建立。

2.1.3 代謝水平

機體內代謝物是基因表達的最終產物，在代謝酶的作用下，其水平變化會受到機體內、外環境等多種因素的綜合影響。由于肝臟是體內最重要的代謝器官，一旦肝臟受到損害，那么機體的最終代謝產物必將會發生變化[32]。陸強等[33]利用核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）對肝癌、肝硬化患者和健康人血清中的代謝物分別進行檢測，發現肝硬化、肝癌患者的血清中乙酰乙酸的含量降低，顯示肝細胞中脂肪酸的分解代謝可能被抑制。進一步研究發現，抗氧化物質牛磺酸在肝硬化患者血清中含量增加，在肝癌患者的血清中卻沒有改變，表明肝硬化患者的肝細胞還可以通過增加合成牛磺酸來抵制自由基的危害，但肝細胞癌變后會導致肝臟內環境穩態遭受嚴重破壞，喪失了自我保護功能。與代償期相比，肝硬化失代償期患者血清中極低密度脂蛋白（Very Low-Density Lipoprotein，VLDL）和低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein，LDL）的水平降低[34]，可能是由于肝組織脂質合成的能力降低所導致。此外，由于肝臟同時還是人體內葡萄糖代謝的重要場所，許多肝硬化患者的空腹血糖高于健康人群，但又明顯低于糖尿病患者，且其C肽及胰島素水平比健康人群及糖尿病患者都高，說明肝硬化患者很可能存在胰島素抵抗[35，36]。

2.1.4 表觀遺傳學水平

表觀遺傳學研究顯示DNA甲基化狀態可能為進一步明確慢性肝病發病機制提供線索[37]。Mann J等[38]首次發現了DNA甲基化在肝星狀細胞激活過程中的作用。該研究用去甲基化藥物處理肝星狀細胞后，發現PPARγ及核轉錄因子kappa B的表達上調，從而可抑制肝星狀細胞向肌成纖維細胞樣細胞轉化，延緩肝硬化的進程。Zhang Y等[39]也通過體外實驗證實，CpG島的甲基化可以顯著減少cccDNA的轉錄及隨后核心病毒DNA的復制；并且在基因P16啟動子甲基化陽性的肝癌、肝硬化和慢性肝炎樣本中沒有發現P16蛋白的表達[40]。在外周血單核細胞中，XPO4基因的甲基化狀態往往是一種非入侵的生物標志物，可用來預測乙型肝炎病毒感染的進程。進一步研究發現，XPO4 mRNA在乙肝及其肝硬化患者中的表達明顯低于正常對照組，而XPO4啟動子的甲基化率在肝癌患者中較正常組則高出很多[41]。腫瘤抑制基因CDO1，通常會在發生癌變時被其啟動子的甲基化作用所沉默，導致表達下降，Yang等[42]分別選取了慢乙肝、肝硬化、肝癌及健康人群的血清進行檢測發現，CDO1啟動子甲基化作用肝硬化及肝癌患者中是明顯高于正常對照組的，且在疾病的晚期，其甲基化也顯著高于疾病早期。

2.2 乙肝后肝硬化“證”的分型與演化

2.2.1 中醫證候分型

在乙肝后肝硬化中醫證型分類研究中，李毅等[43]應用系統聚類方法對276例乙肝后肝硬化患者的癥狀、體征進行研究，認為HBC基本中醫證型分為7類：濕熱內蘊證、肝腎陰虛證、肝郁脾虛證、脾虛濕盛證、脾腎陽虛證、血瘀證、氣（陽）虛證。同時，李毅等[44]還運用卡方檢驗方法對近30年來國內公開報道的肝硬化辨證分型文獻數據進行比較，所得結論也與應用系統聚類方法獲得的結果十分接近。來麗群等[45]發現TGF-β1、肝纖維化指標及肝功能分級與中醫辨證分型密切相關，并認為TGF-β1、肝纖維化指標可以作為HBC的中醫辨證中證型的量化指標。龔向京等[46]發現凋亡相關蛋白TFAR19的表達水平與HBC臨床證候分型密切相關。乙肝后肝硬化患者血清TFAR19的表達水平從實證到虛證過程中呈現由高到低的趨勢，且在偏實、虛實夾雜、偏虛的不同證型之間差別具有統計學意義，但TFAR19表達在瘀血內結證型的不同嚴重程度患者之間無顯著差異，提示該階段有可能是乙肝后肝硬化治療的重要節點。楊新莉等[47，48]對中醫體質類型與乙肝后肝硬化預后相關性進行研究發現，陰虛質和濕熱質是乙肝后肝硬化患者的主要體質類型，其中陰虛質病情最重，預后最差。

2.2.2 中醫證候演化

辨證論治是中醫診治乙肝后肝硬化的主要特色。臨床上乙肝后肝硬化的變證、并證繁多，證型復雜。《內經》曰：“正氣存內，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”。機體發病，多是由于“兩虛相得，外內合邪”。外邪侵襲人體，必然引起體內邪正交爭，而正邪的勝負變化[49]，最終會導致如實證、虛證等不同證候間的動態演變。有研究表明，通過中醫的辨證治療，可有效降低慢乙肝患者肝硬化的發生率或是延長其發展成為肝硬化的病程時間[50]。因此，通過辨證分析乙肝后肝硬化的病證關系，有利于對不同“證”的患者設計個體化的“病”的治療方式。

隨著乙肝后肝硬化患者病情進展，機體的免疫狀態發生改變，中醫證型也隨之發生動態變化[51]，早期由于濕熱疫毒侵犯肝膽、肝失疏泄、彌漫三焦，表現出肝膽濕熱證；中期邪毒留戀，困阻脾胃中焦，出現脾胃濕熱證；后期則因濕熱久羈，郁而化熱，氣血不足，可見肝腎陰虛證。單純虛證或單純實證減少，虛實夾雜證增多[52]，表明乙肝后肝硬化的證候在“病”的發展過程中會隨時間、空間的推移發生動態演化，顯示了乙肝后肝硬化的復雜多變的病證關系。此外，乙肝后肝硬化患者體內HBV病毒復制也與中醫證型的演變一定相關性，HBV-DNA在濕熱蘊結證中復制最為活躍，之后隨著證型在“由實轉虛”的演化過程中，HBV復制逐漸趨于平緩，并在脾虛濕盛證及肝氣郁結證中復制量最低[53]。這種HBV-DNA復制的差異不僅反映了乙肝后肝硬化證候的演變趨勢，也為其辨證治療提供了依據。

3 乙肝后肝硬化“證”的物質基礎

中醫病證在分子水平的物質基礎可能是由相關的基因群或蛋白群體表達異常及特異代謝組分等共同形成[54]，這些分子的變化及其分子間的相互關系是研究中醫病證分子機制的前提。因此，證候的生物物質基礎研究就成為系統闡述乙肝后肝硬化“病”、“證”分子機制的基礎。

3.1 基于基因組學研究的證候物質基礎

基因表達譜研究顯示，乙肝后肝硬化實證主要涉及脂質代謝調節、免疫與炎癥反應及氨基酸代謝，虛證主要涉及過氧化物酶活性、干細胞維持等功能，并參與色氨酸代謝、細胞周期磷酸化調節等信號通路[55]。在對慢乙肝及乙肝后肝硬化“同病異證”、“異病同證”分子機制研究中發現[55]，細胞膜G蛋白受體信號通路相關基因在慢乙肝兩種證型均表達下調，但在乙肝后肝硬化兩種證型中則顯示既有下調又有上調的狀態。進一步對在慢乙肝及乙肝后肝硬化中共表達基因調控網絡研究發現，共表達基因與兩種病的肝膽濕熱證均呈低相關，而與肝郁脾虛證均呈高相關，顯示這些基因可能作為證候判別的重要生物物質基礎[56]。在探討乙肝后肝硬化中醫證候分類與基因表達之間關聯時發現，濕熱蘊結證和肝郁脾虛證間的基因網絡表達模式差異較大[15]。此外，姜在來等[57]通過對慢性乙型肝炎后肝硬化患者中白細胞介素10（Interleukin-10，IL-10）基因單核苷酸多態性的檢測，發現乙肝后肝硬化患者的脾虛濕盛證與IL-10基因819位點C等位基因相關，而其TT基因型則可能是肝硬化患者形成肝氣郁結證的主要原因。而在乙肝后肝硬化肝氣郁結證患者中，與人體情緒調節相關的GNB3基因C825T位點的CC基因型、C等位基因被認為可能是該證候的保護基因，而T等位基因可能是其易感基因[58]。

3.2 基于蛋白質組學研究的證候物質基礎

利用蛋白組技術，周迪等[59]對103例肝硬化患者、29例健康人群及29例慢乙肝患者的血清標本進行檢測，發現了典型肝硬化中醫證候群血清蛋白質組的差異，并由此建立肝硬化各中醫證候血清蛋白質診斷模型。Song Y N等[60]運用SELDI-TOF-MS技術對乙肝后肝硬化3種證型的血清蛋白進行檢測，發現肝硬化患者肝膽濕熱證、肝郁脾虛證、肝腎陰虛證的血清蛋白表達譜具有特征性差異峰，且證候之間有明顯分離的趨勢。安海燕等[61]對乙肝后肝硬化的肝氣郁結證、肝腎陰虛證患者的血清蛋白組進行分析，發現相關差異表達蛋白主要涉及機體代謝、免疫、凝血、內分泌以及腫瘤細胞增殖代謝等多個方面。

3.3 基于代謝組學研究的證候物質基礎

代謝組學一直是證候研究的重要方法之一，郭孜等[62]等對乙肝后肝硬化證候的尿代謝組學研究發現，不同證型的肝硬化患者的尿代謝物均與健康人群存在較大差異，這些差異代謝物大多與能量代謝和氨基酸代謝等通路密切相關，其中在濕熱蘊結證與肝腎陰虛證之間存在支鏈氨基酸的差異，顯示肝硬化患者不同證候間存在不同的尿代謝模式。楊永霞等[63]利用核磁共振技術對乙肝后肝硬化患者血清中代謝產物進行檢測，與對照組相比，患者血清中葡萄糖、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽和肌酸等的含量增高，低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、不飽和脂肪酸類和膽堿等水平下降。提示肝臟損傷引起糖酵解、脂質代謝、三羧酸循環紊亂，進而引起能量代謝異常。

此外，呼雪慶等[64]運用全基因組甲基化芯片技術，進行了乙肝后肝硬化典型證候生物學基礎觀察。結果發現，與健康對照比較，濕熱內蘊證、脾虛濕盛證和肝腎陰虛證各有57、68和94個差異DNA甲基化位點。其中，HLA-DRB1和ADAMTS9、NUDT1和YES1、APOA5和PRKCZ等基因的差異DNA甲基化可能分別與濕熱內蘊證、脾虛濕盛證和肝腎陰虛證證候形成有關。研究提示DNA甲基化可能為乙肝后肝硬化證候分類的生物學依據之一。

4 展望

基因組學、蛋白質組學、代謝組學以及表觀遺傳組學是研究中醫病證分子物質基礎的主要內容，其分子的動態變化及其相互關系是研究中醫病證分子機制的重要切入點。疾病是受到基因組學、蛋白質組學、代謝組學和表觀遺傳組學的調節網絡“干擾”偏離常態而致，證候可能是疾病過程中基因、蛋白質、代謝和表觀遺傳水平受到“干擾”失衡后所發生的一種階段性狀態變化[65]，基因組學、蛋白質組學和表觀遺傳學組學能夠說明可能發生的事件，而代謝組學則反映確實已經發生了的事情。因此，通過這些分子水平的組學研究，可能區分同種不同個體之間的“病證”表型差異，揭示“同病異證”、“異病同證”的分子機制。

盡管迄今中醫病證的分子物質基礎和分子機制研究取得一定進展，但缺乏基因、蛋白質、代謝水平和表觀遺傳水平各分子群之間相互關系的研究，尤其缺少基因、細胞、組織、器官和整體從低層次到高層次關聯研究，這可能是今后乙肝后肝硬化的病證關系的重要研究方向。

乙肝后肝硬化的病證關系十分復雜，盡管中醫對乙肝后肝硬化臨床辨證及對癥治療等已經有了大量探索工作，但系統闡述其中醫病證關系機制依然是中醫藥治療乙肝后肝硬化的重要突破口。特別是隨著系統生物學及生物大數據的快速發展，精準醫療已成為目前預防和治療疾病的一種新方法。由于中醫藥精準醫療是以基因組學、蛋白質組學、代謝組學等技術為基礎，通過大樣本人群與特定疾病類型進行生物標志物的分析、鑒定、驗證，從而精確尋找病證的致病原因及治療靶點等[66]。因此，以病證結合為基礎實現對乙肝后肝硬化患者進行個性化精準治療必然越來越得到人們的認同和應用，從在提高乙肝后肝硬化診治效率及預防等方面產生重要的作用。

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A Study on the Biological Substances of Traditional Chinese Medicine (TCM) Syndrome in Hepatitis B-Caused Cirrhosis

Liu Yamin, Shi Yulin, Chen Jian, Tang Chenchen, Su Shibing, Chen Qilong
(Research Center for TCM Complexity System, Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China)

Hepatitis B-caused cirrhosis (HBC) is a common pathological consequence of chronic hepatitis B at its final stage， which therapeutic efficacy has been challenging in its clinical treatment incredibly. Among the treatments of HBC traditional Chinese medicine (TCM) worked a special therapeutic efficacy. In the past decades，TCM forged the prospect of many chronic disease treatments. However， because of the indistinct relationship between “disease” and “syndrome”， TCM still encountered heaps of challenges in the treatment of HBC. In this study， underlying to the “disease” and “TCM syndrome” of HBC， we summarized the molecular mechanism of “disease” and the biological substances related to “TCM syndrome” from the aspects of genes， proteins， and metabolic and epigenetic levels， respectively. The application and prospects of the personalized TCM treatment of HBC was synopsized based on “disease-TCM syndrome” and TCM precision medicine， for the provision of a theoretical reference for the development of TCM precision treatment for HBC.

Traditional Chinese medicine， Hepatitis B-caused cirrhosis， disease-TCM syndrome， biological substances

10.11842/wst.2016.09.011

R2-031

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-04-18

修回日期：2016-06-13

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81473443）：基于動態生物網絡的慢性乙型肝炎典型證候病證關系分子機制研究，負責人：陳啟龍；上海市科學技術委員會自然科學基金面上項目（14ZR1438800）：基于轉錄組學的慢性乙型肝炎“同病異證”分子機制研究，負責人：陳啟龍。

＊＊ 通訊作者：陳啟龍，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：中醫系統生物學及病證機制。