腦內小分子檢測技術及人參皂苷入腦的研究進展＊

歐陽柳鳳，朱珂璇，邵 曉，張 薔，趙玉男＊＊

（1.延安大學醫學院病理教研室 延安 716000；2.南京中醫藥大學基礎醫學院實驗研究中心 南京 210046）

腦內小分子檢測技術及人參皂苷入腦的研究進展＊

歐陽柳鳳1，朱珂璇2，邵 曉2，張 薔2，趙玉男2＊＊

（1.延安大學醫學院病理教研室 延安 716000；2.南京中醫藥大學基礎醫學院實驗研究中心 南京 210046）

許多中藥在治療中樞神經系統疾病均有療效，但其作用機制并不清楚。本文簡要介紹了血腦屏障（BBB）的生理組成，藥物穿透BBB的途徑，并介紹了3種主要針對腦內小分子物質的檢測技術：高效液相色譜法、免疫組織化學法和放射性同位素標記法。這些技術將有助于小分子入腦的研究，并得出它們在腦組織內的分布以及判斷是否能透過血腦屏障，從而探索它們中樞活性的作用模式。綜合分析國內外的研究人員針對人參皂苷進行了其入腦的研究可得：人參皂苷可以到達BBB，作用于微血管內皮細胞或星形膠質細胞間接發揮中樞活性，至于是否能透過BBB到達神經元，仍需進一步的研究確認。

人參皂苷 血腦屏障 高效液相色譜法 免疫組化 放射性同位素標記

現代藥理學研究發現，許多中藥有效成分均具有中樞活性，能很好的治療中樞神經系統疾病，如人參的有效成分人參皂苷[1]。然而，目前中藥有效成分發揮中樞活性的作用模式并不明朗，其作用靶點可能位于中樞或外周。由于血腦屏障（Blood Brain Barrier，BBB）的存在，可以推斷出中藥有效成分中樞活性的作用模式可能為直接作用于神經元或是通過構成BBB的內皮細胞或星形膠質細胞間接發揮其中樞活性。因此，腦內小分子物質的檢測主要有兩個目標：一是判斷其能否到達BBB；二是能否透過BBB進入腦組織，接觸神經元?；谶@種研究需求，本文簡要介紹了血腦屏障的構成、藥物穿透BBB的途徑以及3種主要腦內小分子檢測分析技術：高效液相色 譜 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）和放射性同位素標記法。這些技術將有助于研究中藥有效成分中樞活性的作用模式；同時，本文還以人參皂苷為例，結合本實驗室的研究結果，對人參皂苷入腦研究進行了歸納總結。

1 血腦屏障

1.1 BBB的基本組成及其生理作用

BBB是保護腦組織的天然生理屏障，是存在于腦組織和血液之間的一個復雜細胞系統，通過控制血腦兩側的物質轉運，保證了中樞神經組織內環境的穩定[2]。它由緊密連接的血管內皮細胞、基底膜以及星形膠質細胞的足突組成，為BBB的“物理屏障”。毛細血管內皮細胞最重要的作用就是：使處于循環中的內源性和外源性物質無法輕易穿過自身進入腦組織。腦內的毛細血管內皮細胞有著連續的緊密連接、胞飲作用活力低、不存在開孔[3]，構成BBB并調控其通透性。星形膠質細胞構成血腦屏障的第二道屏障，星形膠質細胞的終足，貼附于毛細血管外周形成膠質膜，包繞了毛細血管85%的表面。膠質細胞膜也是血腦屏障不可缺少的一層，其作用不單是機械阻擋，在促進微血管內皮細胞的荷電性和誘導 BBB 功能等方面都發揮著重要作用[4，5]。終足還能釋放化學因子和信號參與調控腦內毛細血管內皮細胞，在維持腦微血管內皮細胞的屏障特性和控制腦血流方面，也起決定性的作用[6]。BBB是具有生理功能的動態屏障。對于不同的化學物質，能夠特異性、選擇性地控制它們進入與排出腦組織[7]。在正常生理情況下僅允許氣體分子及相對分子質量小于400-600的脂溶性小分子通過，除了被動保護作用外，它還能選擇性地將腦內有害或過剩物質泵出腦外，從而保持腦的內環境穩定，使中樞神經系統能有效地執行功能。

1.2 穿透BBB的途徑

BBB并不能阻止所有物質進出大腦，一些物質例如具有脂溶性、一定分子質量及電荷的小分子物質能夠直接從血液擴散穿越BBB進入中樞神經系統。大多數物質必須通過與血管內皮細胞腔面細胞膜上所表達的特殊轉運體和（或）受體相互作用，才可以穿過BBB，進行物質代謝?，F已知物質透過BBB的機制有以下3種：①有些水溶性小分子物質可經在血管內皮細胞腔面及基底側的轉運體轉運入腦；②相對分子量更大的親水性物質可經胞吞或跨膜轉運穿過BBB；③一些脂溶性小分子可通過被動擴散入腦。然而，不管通過何種方式入腦，藥物在進入腦組織之前都會與血管內皮細胞或星形膠質細胞胞質存在的降解酶接觸而被降解或代謝，其原型或代謝物最終會通過BBB的血管內皮細胞管腔側所表達的排出泵（如：P-糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白2、乳腺癌耐藥蛋白等）而被泵出，從而限制藥物進入腦組織的量，可以看成BBB的“代謝屏障”[8，9]。

1.2.1 被動擴散

被動擴散僅適合小分子、親脂性、非極性的物質。脂溶性氣體如O2和CO2通過血管壁進行充分的交換；BBB允許脂溶性高的物質通過，如丁醇，不允許脂溶性低的分子通過，如甘露醇；BBB對許多物質的通透系數與這些物質的脂溶度即油-水比例系數呈正相關：如尼古丁和海洛因油-水比例系數較高，在一定范圍內增加藥物脂溶度就較易于進入腦組織[10]。

1.2.2 跨膜轉運

大多數非脂溶性物質以及大分子物質主要通過跨膜轉運透過BBB。這些物質必須與特異性的載體或受體結合，改變構相后跨過脂質膜性BBB，再與之分離。

水溶性小分子物質主要是通過血管內皮細胞血管腔面與基底側上所表達的轉運體轉運穿過BBB。腦必需的每一種主要的營養物質都有特定的輸送器[11]，這些輸送器能識別營養物質分子，輸送它穿過胞膜。葡萄糖是腦組織惟一的能量來源，BBB內皮細胞存在著的己糖轉運裝置即同型葡萄糖轉運裝置即是一個很好的例證。由于其轉運為非耗能性過程，故不能逆濃度差運載葡萄糖。葡萄糖的凈流量是由血漿中相對較高濃度所驅動。氨基酸跨膜方式與葡萄糖相似，但其轉運體可以分為3種：①大分子中性氨基酸系統（Large Neutral Amino Acid，LNAA）或稱亮氨酸系統，運送多種氨基酸，但對大分子氨基酸優先；②丙氨酸優先系統，僅僅存在于BBB的腔面；③必需氨基酸系統，主要轉運精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸等。葡萄糖轉運體（Glucose Transporter 1，GLUT1）、氨基酸轉運體（L-type amino Acid Transporter-1，LAT1）等特異的內源性載體，還可以和一些具有相近結構的小分子藥物結合，從而協助它們穿過BBB。如水溶性的天麻素能直接入腦，并迅速代謝為天麻苷元，與其化學結構有關[12]。天麻素是由天麻苷元與一分子葡萄糖構成，苷元部分可視為葡萄糖的取代基，因此，可能是通過腦毛細血管內的內皮細胞上特異性的葡萄糖載體轉運至腦內。

相對分子質量更大和（或）親水的物質，如激素、轉鐵蛋白、胰島素和脂蛋白主要利用血管內皮細胞的管腔側高度表達的特殊受體進行轉運，這些受體的作用是介導化合物經過胞吞或跨細胞轉運穿過BBB。

在腦極后區、下丘腦正中隆起、后聯合下器官、垂體后葉、松果體、脈絡叢，存在“腦的特殊區”，其特點為血竇多，竇外僅有嗜銀網狀纖維包裹，無膠質突，毛細血管內皮有小孔，基膜不連續并與鄰近膠質突分開，有較大的通透性。在這些特殊區域可允許某些大分子化合物，如激素和一些毒物少量進入，這可能具有它特殊的生物學意義。此外，離子通道和離子轉運系統可傳遞電解質通過BBB。

2 腦內小分子檢測技術

檢測小分子物質是否入腦的方法有很多，主要有腦組織勻漿、腦脊液、腦部微透析液聯合HPLC、免疫組織化學技術以及放射性同位素標記法等。為了探討中藥有效成分中樞活性的作用模式，探討其作用于中樞還是外周，必須知道其能否到達BBB，以及能否透過BBB。HPLC配合腦組織勻漿法可判斷待測物質能否到達BBB；如果能，即待測物質可能分布于構成BBB的星形膠質細胞和（或）血管內皮細胞；而其他的檢測技術都能判斷待測物質能否透過BBB；如果能，說明待測物質能直接作用于神經元。同時，免疫組織化學技術和放射性同位素標記法還能對待測物質進行定位，清楚明了地顯示其具體分布于哪個細胞以及分布情況。這些檢測分析技術，可以為研究中藥有效成分的中樞作用模式提供直接明了的證據。

2.1 HPLC

HPLC為色譜法的一個重要分支，具有高壓、高速、高效、高靈敏度以及應用范圍廣等特點，此外HPLC還具有樣品不被破壞、色譜柱可反復使用以及易回收等優點。但HPLC也存在“柱外效應”，從而柱效率降低。液相色譜和質譜連接，即液-質聯用（HPLC-MS）既具有液相強大的分離能力，又具有質譜高靈敏度、高選擇性、高分辨率的特點，已經成為研究藥物微量雜質分析鑒定、藥物降解產物分析鑒定、藥代動力學、組合化學高通量篩選等最用力的分析工具之一。它主要用來分析難揮發或者熱不穩定、中性或者極性大的化合物，適用于大多數藥物及其代謝產物的定性和定量研究。

2.1.1 腦組織勻漿

腦組織勻漿樣品采集過程一般為：灌注后取腦組織，生理鹽水勻漿，離心取上清，然后進行樣品預處理，處理好的樣品通過HPLC/HPLC-MS的檢測方法檢測。

采用HPLC檢測腦組織勻漿液中的中藥有效成分，是目前比較常用的檢測方法。董小平等[13]將梔子苷給藥大鼠后，各時間段分別取腦組織勻漿，HPLC法測定腦組織樣本中梔子苷的量，發現冰片可提高梔子苷入腦量和入腦速度。川芎嗪微乳與其水溶液分別尾靜脈給藥，用HPLC法測定不同時間點小鼠血、肝、腦中的川芎嗪質量濃度，發現微乳改變了川芎嗪在小鼠血漿、肝、腦中藥動學行為，提高了川芎嗪在腦、血、肝，特別是腦中的分布[14]。為了闡明苦碟子注射液中的4種黃酮類成分在血漿、心肌及腦組織的藥代動力學特征，有研究采用超高效液相色譜－三重四級桿質譜聯用技術（UPLC-MS/MS）建立同時測定苦碟子注射液中4種黃酮類成分在大鼠血漿、腦組織、心肌組織中濃度的含量[15]。米佳等[16]采用HPLC測定腦組織中天麻苷元含量，測得天麻與鉤藤配伍對天麻苷元在大鼠腦組織中分布具有先抑制后促進的影響。不過，在腦組織勻漿中測定待測成分，并不能說明待測成分可以透過BBB，它也有可能僅存在構成BBB的星形膠質細胞和（或）血管內皮細胞中。此外，如果血液灌注不充分或不進行灌注，很容易得到假陽性結果。

2.1.2 腦脊液

目前，抽取腦脊液的方法主要有經延髓池穿刺和經側腦室穿刺兩種[17-20]。這兩種方法相比較，經側腦室穿刺操作較復雜，且易造成腦組織損傷和出血；而經延髓池穿刺方法簡單、迅速，易于掌握，因此經延髓池穿刺抽取腦脊液法在各實驗室更為常用。抽取的腦脊液經預處理后，采用HPLC/HPLC-MS進行檢測分析。

HPLC-MS也是檢測腦脊液中中藥有效成分較常見的一種檢測分析手段。腦脊液中如能檢測到待測物質，則說明該物質能透過BBB。楊雁芳等[21]采用HPLC-MS/MS的方法，研究黃芩苷及配伍三七總皂苷在大鼠腦脊液藥代動力學變化，在給藥腦脊液中能檢測到黃芪苷，并且其在腦脊液中的代謝不受三七總皂苷影響，認為黃芩苷能透過BBB。吳建明等[22]以大鼠口服疏肝解郁膠囊后，建立腦脊液HPLC指紋圖譜，在腦脊液中檢出5種成分。吳霜[23]建立HPLC測定法檢測天麻的4種活性成分及代謝產物在腦脊液中的濃度，口服給藥，發現其中有2種成分其原形和代謝產物穿透BBB能力強，還有2種其原形和代謝產物穿透能力弱。

2.1.3 微透析液

微透析技術是對活動動物特定腦區內灌流液進行實時監測的一種新方法。該項技術能在麻醉或清醒的生物體上使用，非常適合于深部組織和重要器官的活體生化研究。腦內微透析技術有以下優勢：①由于大分子的蛋白質不能透過半透膜，因此得到的腦透析液樣品可以直接進行HPLC檢測，樣品不需提純，且還可以避免酶對神經肽的降解作用。②透析液樣品是在清醒的活體動物中獲得，還可在透析的同時觀察動物的行為。生物指標結合行為學，可更科學的解釋實驗結果。③這種技術可以節省實驗動物，動物自身可成空白對照，且實驗的空間準確性要優于其他技術手段。

腦內微透析技術與HPLC-MS這種靈敏的檢測分析系統相結合，主要用于檢測腦內細胞外液中許多神經遞質如乙酰膽堿、去甲腎上腺素等及它們的代謝產物、小的肽類、游離氨基酸、磷酸乙醇胺、維生素、各種離子等濃度的變化?，F代研究學者也將此法運用于檢測腦內中藥有效成分的動態濃度變化。呂允鳳[24]考察不同劑量天麻素皮下及口服給藥后，大鼠腦內的天麻素及其代謝產物天麻苷元的濃度變化。采用腦內微透析技術對大鼠進行在體動態取樣，得到透析液以HPLC-串聯四級桿質譜方法測定天麻素含量， HPLC-二極管陣列檢測方法測定天麻苷元含量。結果顯示，無論皮下及口服給藥，天麻素濃度在不同腦區內均較低，天麻苷元腦內濃度則明顯高于其原型天麻素。因此，天麻素的BBB透過能力差，而其活性代謝產物天麻苷元卻能夠較好地進入腦內發揮作用。方浩[25]以微透析技術和傳統采樣方法研究鹽酸麻黃堿在大鼠額葉皮層細胞外液和血漿中藥動學過程，比較研究兩種方法所得主要藥動學參數之間的區別與聯系，探討靶器官藥動學研究方法。

但腦內微透析技術在應用中也存在不足之處：①實驗操作較復雜，需能熟練使用微透析泵及立體定位儀，否則易造成較大的人為誤差。②透析膜的回收率測定始終是一個沒有很好解決的問題，回收率測定的不準確會直接限制該項技術在測定腦內物質絕對濃度時的應用。③微透析探頭植入的位置、透析膜面積、截留分子量、溫度、灌流速度、產生的損傷等都會對實驗結果產生影響，同時探頭植入大腦的時候可能會阻塞針孔，而且灌流的量也不好把握。④微透析探頭的植入有可能破壞BBB，得到假陽性結果。

2.2 IHC

IHC是檢測組織切片或細胞標本中某些物質分布及在組織或細胞中含量的定性、定量、定位研究的方法。IHC具有特異性強、敏感性高、定位準確和定量等優點。

應用IHC這種免疫分析技術，凡是能作為抗原或半抗原的物質都能用相應的抗體在組織或細胞中檢測到。而采用IHC檢測小分子物質中藥有效成分，需要提供其抗體，這就需要應用到半抗原抗體技術。

2.2.1 半抗原抗體技術

隨著免疫分析技術的不斷發展進步，中藥有效成分半抗原抗體技術已經被運用到中藥的各個現代化研究領域。合成具有良好免疫原性的抗原是建立免疫分析技術的前提和關鍵所在。大多數中藥的有效成分是小分子物質[26，27]，如有機酸類、黃酮類、木脂素類、蒽醌類、萜類及皂苷類，這些小分子物質一般都只有反應原性而沒有免疫原性，因此需要偶聯載體蛋白來形成完全抗原。目前，常見的偶聯方法有以下幾種：①有機酸類利用碳二亞胺法使羧基與載體上的氨基偶聯，如綠原酸[28]、柚皮苷等[29]；②黃酮類利用混合酸酐法使酚羥基或羧基先與氯甲酸異丁酯生成混合酸酐，再與載體上的伯胺基偶聯，如橙皮苷[30]；③木脂素類和蒽醌類利用重氮法，其活潑氫可與氮化修飾的載體偶聯，如Agatharesinol[31]、大黃素等[32]；④萜類和皂苷類利用高碘酸鈉法將糖基氧化成醛基，再與載體上的氨基偶聯，如紫杉醇[33]、人參皂苷Re[34]等；⑤萜類利用半琥珀酸鹽法將羥基與琥珀酸酐反應生成羧基，再偶聯載體上的氨基，如雷公藤內酯醇[35]。

2.2.2 半抗原抗體技術的檢測應用

近年來，大量的研究發現，半抗原抗體技術已經被廣泛應用于各個方面：如酶聯免疫檢測、Knockout提取物、免疫親和提取、分子育種以及細胞免疫組化等。其中，酶聯免疫檢測可用于中藥質量控制和藥代動力學研究。與色譜法相比，半抗原抗體技術具有易操作、樣品前處理簡單、反應速度快、費用低以及適用于大批量樣品等優點，其靈敏度ELISA可以是HPLC的20倍以上，甚至達到液質的檢測靈敏度。其檢測結果也能與HPLC結果一致。Knockout提取物能選擇性剔除復方或有效成分混合物中的某單個成分，在研究復合物中的某單一成分在復合物中所處的地位方面有著重要作用：如Yuan等[36]發現西洋參漿果有降低成年糖尿病小鼠血糖水平的作用，而剔除掉漿果中的人參皂苷Re成分，則降血糖的效應明顯變弱，說明人參皂苷Re在漿果降血糖作用中占重要地位。免疫親和提取是將半抗原抗體連接到固相載體上，再通過抗原抗體的特異性反應吸附樣品中的半抗原，再將半抗原洗脫，通過HPLC或ELISA分析，測得復雜樣品中該種小分子半抗原的含量。這種方法可以用于比較高效的樣品前處理，或獲得高純度的中藥有效成分。如用于對食品質量的監控：林維宣[43]以單克隆免疫親和柱-HPLC測定醬油中伏馬毒素B1、B2，以免疫親和柱凈化樣品。用于免疫組化，則是將半抗原抗體作為一抗，因其抗原抗體的特異性結合，形成的免疫復合物，再與標記的二抗結合，可直觀的檢測到待測物質的分布，可為中藥有效成分的作用靶點提供依據[37]。

2.3 放射性同位素標記法

同位素標記法是以放射影像學方法來證實其是否透過BBB或其在腦內的分布。因存在放射污染，目前該項檢測技術已不被眾多實驗室考慮。但這項技術憑借其特有的追蹤顯影的優勢，依然被應用于各個領域。

Rokka等[38]合成了一種（18）F-標記的姜黃素衍生物，并通過電子發射斷層掃描（PET）轉基因APP23小鼠模型的β-amyloid斑塊，發現斑塊在血液中清除的較快，得出姜黃素對于阿爾茲海默病（Alzheimer Disease，AD）有治療效果。2型大麻素受體（Type 2 Cannabinoid Receptors，CB2）在神經炎癥和神經退行性疾病中起著重要的作用，Mu等[39]為了證明大麻素對阿爾茨海默病是一種非常有前途的治療方法，通過合成的放射性標記的CB2大鼠和小鼠脾片和腦片進行體外放射自顯影，觀察腦片和脾片動態正電子發射斷層掃描，發現與CB2受體激動劑的結合性較高，說明這種方法可以用來研究大麻素是否可以穿越BBB。

綜上所述，許多中藥有效成分在中樞神經系統方面存在多種已知藥效，然而關于其在腦內的具體作用部位方面尚無任何報導。采用HPLC配合腦組織勻漿法能初步判斷中藥有效成分能否到達BBB，HPLC配合腦脊液、透析液法以及IHC和放射性同位素標記法可以判斷中藥有效成分是否透過BBB，并且IHC和放射性同位素標記法還能直觀顯示藥物具體到達哪個細胞以及分布量的多少。以上檢測手段各有優劣，在研究中藥有效成分的中樞作用模式方面亦各具千秋，這些技術手段為研究中藥在腦內的作用靶點提供新的研究路徑，為中樞神經系統藥物的研發提供新的思路。

3 人參皂苷入腦的研究

人參是祖國傳統名貴中藥之一，人參皂苷為人參的主要有效成分。已有大量的現代研究證明，人參皂苷在中樞神經系統疾病方面有著很明確的療效，并因其毒副作用小以及西藥難以匹及的保健預防效果而成為臨床研究熱點。因此，關于人參皂苷作用機制的研究也日漸熱門，人參皂苷可通過抗氧化、抗凋亡、調節蛋白表達、調節腦內興奮性氨基酸含量等多種機制達到保護神經元的作用。人參皂苷的中樞活性可能有以下3種作用模式：①人參皂苷能透過BBB直接作用于神經元；②人參皂苷不能透過BBB，但是能到達BBB，通過構成BBB的內皮細胞或星形膠質細胞間接作用發揮其中樞活性；③人參皂苷不能透過BBB，也不能達到BBB，通過外周間接發揮其中樞活性。目前，有研究報道稱發現人參皂苷能到達BBB，這掀起了一股探討人參皂苷能否透過BBB的研究熱潮。大多數研究趨向于人參皂苷不能透過BBB這個觀點，但也有少量研究發現人參皂苷能透過BBB。因此，關于人參皂苷是否入腦及人參皂苷的具體作用部位的研究已經亟待開展。本實驗室即以多種檢測分析方法，來探討人參的有效成分人參皂苷能否入腦并進一步研究其在小鼠腦組織中的分布，旨在明確人參皂苷作用于腦的具體部位，為中藥有效成分的作用靶點研究提供研究方向，為指導臨床用藥提供依據。

3.1 人參皂苷能否到達BBB

當前，已有研究在腦組織勻漿中檢測到了人參皂苷。陳新梅[40]在勻漿液樣品中分別加入不同濃度的人參皂苷Rg1標準溶液，配制成高、中、低3個質量濃度的生物樣品，然后按生物樣品的處理方法進行處理后，利用HPLC測定其回收率和精密度，能在腦組織中測得人參皂苷Rg1。郝成欣[41]通過靜脈注射人參皂苷Rb1，腦組織勻漿樣品采用HPLC檢測，測得人參皂苷Rb1在腦組織中5 min可達高峰，之后含量明顯下降，30 min后不能再檢測到。陳鋼等[42]采用HPLC測定人參皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1在腦脊液和腦組織中的濃度，通過測定其回收率和精密度，得到其藥代動力學參數，并在腦組織中檢測出這3種物質。張穎等[43]灌胃給藥，發現人參皂苷在塞絡通作用下，能迅速吸收進入腦組織內。采用HPLC-MS的檢測方法，測得人參皂苷單體Rg1、Re、Rb1、Rc在腦組織中含量較高。然而，這些文獻研究中，腦組織均未灌注清洗或僅以PBS洗去表面浮血，腦組織勻漿液中可能含有血液而導致假陽性結果。

本實驗室采用了HPLC-MS以及免疫熒光雙染技術來探討這個問題：HPLC-MS檢測腦組織勻漿中的人參皂苷，并在獲得腦組織勻漿樣品過程中，特別以PBS心臟灌注清洗腦組織中的血液，排除樣品中含有血液帶來的假陽性結果，結果測得樣品中含有人參皂苷Rg1。該實驗結果支持人參皂苷能到達BBB；同時本實驗室還采用半抗原抗體技術，將制得的人參皂苷抗體與膠質纖維酸性蛋白（Collagen Fibre Acidic Protein，GFAP）和von Willebrand因子（vWF）抗體兩兩聯用，通過免疫熒光雙染法在構成BBB的星形膠質細胞和血管內皮細胞中發現了人參皂苷。因此，本實驗室通過實驗認為人參皂苷能到達BBB[44]。

3.2 人參皂苷能否透過BBB

關于人參皂苷能否透過BBB，大部分學者認為人參皂苷不能透過BBB：如Wang等[45]發現無論體內還是體外實驗，人參皂苷Rg1能透過BBB的能力都很弱。吳雪[46]發現芳香開竅藥可助羥基紅花黃色素A、葛根素、川芎嗪入腦，但并不能引人參皂苷Rg1入腦。但也有研究發現人參皂苷在通絡藥的作用下能透過BBB，甚至在無任何輔助藥物時也能透過BBB。張穎等[43]發現，塞絡通能促進人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc迅速入腦，尤其是Rg1和Re。李磊等[47]尾靜脈給藥大鼠，采用HPLC-MS測定方法，能在腦脊液中檢測到人參皂苷Rg1，并發現解毒通絡方并不影響其在腦脊液中的代謝。Xue等[48]收集大鼠大腦額葉中區、海馬區以及側腦室微透析液，采用HPLCMS來研究人參皂苷Rg1在腦內的藥代動力學，發現Rg1能透過BBB。

本實驗室也采用了HPLC-MS以及免疫熒光雙染技術來探討這個問題：以HPLC-MS的檢測方法，并沒有在腦脊液中檢測到人參皂苷，這個實驗結果似乎支持人參皂苷不能透過BBB；而在免疫熒光雙染實驗中，發現大多數神經元內沒有人參皂苷，但還是有一些神經元上有人參皂苷陽性顯示，說明有人參皂苷能透過BBB作用于少數神經元。至于腦脊液中沒有檢測到人參皂苷，原因可能和進入神經元的人參皂苷極性小或者含量低有關，因而在腦脊液中不能被HPLC-MS檢測到，卻能用免疫組織化學的方法捕捉到。

本實驗室采用IHC的檢測方法來測定人參皂苷在腦組織中的具體分布，這種免疫分析技術相較而言特異性強、靈敏度高、定位準確，能直觀明了地顯示人參皂苷的分布。但也不能排除假陽性的可能，人參皂苷在神經元中的陽性顯色也可能僅僅是背景著色。為了使實驗更具說服力，在未來的研究中，還需要采取更多的技術手段來佐證這個結論。如采用靈敏度更高的同位素標記法來追蹤腦組織中人參皂苷單體或代謝產物等。因此，如何使實驗結論更完善，并明確透過BBB的人參皂苷或代謝產物具體有哪些，這將是研究學者們下一步的研究任務。

4 小結

綜上所述，小分子成分可通過被動擴散和主動轉運，克服BBB的“物理屏障”和“代謝屏障”進入腦組織，分布于內皮細胞、星形膠質細胞和神經元等內。HPLC配合腦組織勻漿、腦脊液、透析液以及IHC和放射性同位素標記法可以用于小分子藥物入腦的研究，并得出它們在腦組織內的分布以及判斷是否能透過血腦屏障。基于上述技術，結合我們和其他研究人員的發現，目前基本可以得出人參皂苷可以到達BBB，通過作用于微血管內皮細胞或星形膠質細胞間接發揮中樞活性。至于是否能透過BBB到達神經元，大部分的研究結果都不支持。不過，我們采用IHC技術發現在少量神經元里有人參皂苷存在，該發現雖有所突破，但未來依然需要更多的證據來支持該結果。

1 Song X Y, Hu J F, Chu S F, et al. Ginsenoside Rg1 attenuates okadaic acid induced spatial memory impairment by the GSK3 beta/tau signaling pathway and the Abeta formation prevention in rats. Eur J Pharmacol, 2013, 710(1-3): 29-38.

2 Deeken J F, Loscher R W. The blood-brain barrier and cancer：transporters，treatment，and Trojan horses. Clin Cancer Res, 2007, 13(6): 1663-1674.

3 馬金柱,王化磊,鄭學星,等. 天然免疫屏障-血腦屏障調節的研究進展. 細胞與分子免疫學雜志, 2013, 29(8): 885-887.

4 周虎傳,張玉波,劉磊. 血腦屏障結構的細胞學與分子學機制的研究現狀. 中國實用神經疾病雜志,2016,19(11):98.

5 Persidsky Y, Ramirez S H, Haorah J, et al. Blood-brainbarrier: structural components and function under physiologic andpathologic conditions. J Neuro immune Pharmacol, 2006,1(3) : 223-236.

6 Colgan O C, Collins N T, Ferguson G, et al. Influence of basolateral condition on the regulation of brain microvascular endothelial tightjunction properties and barrier function. Brain Res, 2008,1193:84-92.

7 胡瀟,余涓.星形膠質細胞在血腦屏障與神經元損傷中的作用. 神經解剖學雜志,2012,28(3):330-334

8 王玉璘,王少峽,郭虹,等.血腦屏障中P-糖蛋白的調節機制. 中國藥理學通報,2011,27(9):1196-1200.

9 陸榕,孫進,趙春順,等. 轉運蛋白在藥物血腦屏障轉運中的重要作用.中國新藥與臨床雜志,2007,26(l):64-71.

10 武士京,陳世畯. 血腦屏障—解剖與生理. 現代神經疾病雜志,2003,3(2):124-128.

11 Spector R. Myo-inositol transport through the blood-brain barrier. Neurochem Res, 1988, 13(8): 785.

12 蔡錚,侯世祥,劉中秋. 灌胃天麻素小鼠腦組織中天麻苷元的藥動學研究.中草藥,2009,40(3) : 389-391.

13 董小平,阮鳴,喻斌,等.不同劑量冰片對梔子苷在大鼠腦內濃度的影響. 中草藥,2012, 43(7):1366-1370.

14 王利勝,郭琦,韓堅,等.川芎嗪在小鼠血、腦和肝中的藥動學研究.中草藥, 2009, 40(6): 935-938.

15 尹佩華. 苦碟子注射液主要成分在大鼠心腦組織分布規律的研究.北京:北京中醫藥大學碩士學位論文, 2015.

16 米佳,王興,董雨,等.天麻與鉤藤配伍前后效應成分在SHR大鼠腦組織的分布. 中國實驗方劑學雜志,2014, 20(18): 105-107.

17 楊子,賴關朝,王國彬,等. SD大鼠腦脊液采集方法改進. 中國職業醫學,2011,38(2):117-119.

18 任長虹,高明清,曹金強,等. 大鼠腦脊液抽取的新方法. 實驗動物科學,2012,29(1):61-62.

19 王松軍,孟小楷,叢斌,等.大鼠腦脊液抽取方法的改良.河北醫科大學學報,2010,31(2):125-127.

20 曹遠東,章龍珍,王梅申,等.兩種采集SD大鼠腦脊液方法的比較.徐州醫學院學報, 2005, 25(4):317-319.

21 楊雁芳,李智,王磊,等. 黃芩苷及三七總皂苷配伍腦脊液藥代動力學研究. 中國藥理學通報, 2012,28(7): 1005-1010.

22 吳建明,柯瀟,張志榮,等. 舒肝解郁膠囊在大鼠血清及腦脊液中的成分分析. 華西藥學雜志, 2014,29(5): 559-561.

23 吳霜. 天麻四種活性成分在大鼠體內血藥濃度和腦組織分布的研究. 云南中醫學院,2015.

24 呂允鳳. 微透析和高效液相色譜法測定大鼠腦內天麻素及天麻苷元含量. 實用藥物與臨床, 2014, 17(3):326-329。

25 方浩. 鹽酸麻黃堿在大鼠血液與額葉皮層中藥動學比較研究.蕪湖:皖南醫學院碩士學位論文,2013.

26 廖國平. 中藥有效成分半抗原抗體制備技術的研究進展. 中成藥, 2011,33(6):1025-1029.

27 趙玉男. 中藥有效成分半抗原抗體應用研究進展. 中國中藥雜志, 2013,38(5):657-660.

28 林輝,劉屏,王建勛,等. 綠原酸人工抗原的合成及反應條件的優化. 中國中藥雜志,2009, 34(15):1906-1909.

29 陳亮,陳婷,徐強,等. 免疫親和色譜特異性剔除中藥方劑四逆散中的柚皮苷. 色譜,2006,24(3): 243-246.

30 Shinkaruk S, Lamothe V, Schmitter J M, et al. Development and validation of two new sensitive ELISAs for hesperetin and naringenin in biological fluids. Food Chem, 2010, 118(2):472.

31 Pasaki T, Yasuda S, Imai T, et al. Preparation of antibody against agatharesinol, a norlignan, using a hapten-carrier conjugate. Phytochemistry, 2011, 58(6):833.

32 李麗華,劉文泰,戴軍,等. 大黃素-BSA不同表位構型的免疫原性和特異性研究. 中國免疫學雜志, 2011,27(5):419-422.

33 Paul G , Raybould T J , Gary S B , et al. An enzyme immunoassay for the determination of taxol and taxanes in Taxus sp. Tissues and human plasma. J Immunol Methods, 1993, 158(1): 5-15.

34 Morinaga O M, Tanaka H , Shoyama Y, et al. Detection and quantication of ginsenoside Re in ginseng samples by a chromatographic immunostaining method using monoclonal antibody against ginsenoside Re. J Chromatogr B, 2006, 830 : 100-104.

35 唐波,劉曉,徐曉昱,等. 雷公藤內酯醇人工抗原的合成及多克隆抗體的制備. 東南大學學報, 2008, 27(6):409-414.

36 Yuan C S, Tanaka H. Bioactivity of American ginseng by knockout extract preparation using monoclonal sntibody. Curr Drug Discov Technol, 2011, 8(1):32.

37 林維宣,田苗,隋凱. 單克隆免疫親和柱-高效液相色譜法測定醬油中伏馬毒素B1、B2.中國調味品, 2001, 1:26-28.

38 Rokka J, Snellman A, Zona C, et al. Synthesis and evaluation of a (18) F-curcumin derivate for β-amyloid plaque imaging. Bioorg Med Chem, 2014, 22(9):2753-2762.

39 Mu L, Bieri D, Slavik R, et al. Radiolabeling and in vitro /in vivo evaluation of N-(1-adamantyl)-8-methoxy-4-oxo-1-phenyl-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide as a PET probe for imaging cannabinoid type 2 receptor. J Neurochem, 2013, 126(5):616-624.

40 陳新梅.劑型因素和給藥途徑對人參皂苷Rg1在大鼠血清和腦組織中分布的影響. 中國實驗方劑學雜志, 2011,17(14): 43-46.

41 郝成欣. 靜脈注射人參皂苷Rb1在小鼠腦組織分布. 科技資訊, 2014,33: 249-250.

42 陳鋼,牧磊,張曉,等. 三七總皂苷多成分經鼓室給藥的體內分布及藥代動力學研究. 中國中藥雜志, 2011,36(13): 1815-1820.

43 張穎,林力,劉光宇,等. 塞絡通灌胃后人參皂苷在大鼠體內的藥代動力學及腦分布研究.中國中藥雜志, 2014,39(2): 316-321.

44 歐陽柳鳳. 基于半抗原抗體技術研究人參皂苷在腦組織內的分布.南京:南京中醫藥大學碩士學位論文, 2016.

45 Wang R, Li Y, Wang G, et al. Neuroprotective effects and brain transport of ginsenoside Rg1. Chin J Nat Med, 2009, 7(4): 315-320.

46 吳雪. 芳香開竅藥冰片及石菖蒲對腦得生主要活性成分透過BBB影響的研究. 長沙:中南大學碩士學位論文,2010.

47 李磊,張麗慧,李智,等. 解毒通絡方中三七皂苷類成分腦脊液藥代動力學研究. 中國藥理學通報, 2014, 1 (30):126-131.

48 Xue W, Liu Y, Qi W Y, et al. Pharmacokinetics of ginsenoside Rg1 in rat medial prefrontal cortex, hippocampus, and lateral ventricle after subcutaneous administration. J Asian Nat Prod Res, 2016, 18(6):587-595

Studies on Detection Technology of Small Molecular Substance in Brain and Distribution of ginsenosides in Brain Tissues

Ouyang Liufeng1, Zhu Kexuan2, Shao Xiao2, Zhang Qiang2, Zhao Yunan2
(1. Laboratory of Pathological Sciences, Medical College, Yan'an University, Yan'an 716000, China; 2. Research Center, Basic Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

A lot of traditional Chinese medicine presented favorable efficacy on central nervous system disease. However， its functioning mode of central activity has not been clarified. This study briefly introduced the physiological compositions of blood brain barrier (BBB) and the pathways as drugs penetrated BBB， and three main techniques of the detections of small molecules in the brain tissues， involving high performance liquid chromatography (HPLC)， immunohistochemistry (IHC) and radioactive isotope labeling. These technologies was beneficial to detecting small molecules in the brain tissues and determining their penetration rate through BBB， in order to elucidate their functioning mode of central activities. Both domestic and foreign researchers have implemented volumes of studies on the detection of ginsenosides in the brain tissues， from which can be concluded that ginsenosides performed central activities as they reached BBB and targeted on microvascular endothelial cells or astrocytes. However， whether ginsenosides penetrated BBB and acted on neurons need verifying.

Ginsenoside， blood brain barrier， high performance liquid chromatography， immunohistochemistry，radioactive isotope labeling

10.11842/wst.2016.09.022

R966

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-09-20

＊ 國家自然科學基金委青年基金項目（81303246）：腦局部糖原代謝在人參總皂苷抗應激致海馬結構可塑性損傷中的作用研究，負責人：趙玉男；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（中西醫結合），負責人：黃熙。

＊＊ 通訊作者：趙玉男，副教授，主要研究方向：中藥藥理學。