六味地黃湯聯合來氟米特、潑尼松治療大鼠IgA腎病的研究*

賈利寧　楊　陽　高　明　馬曉桃　張星映　付榮國

西安交通大學第二附屬醫院腎病科(西安 710004)

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六味地黃湯聯合來氟米特、潑尼松治療大鼠IgA腎病的研究*

賈利寧楊陽△高明▲馬曉桃張星映付榮國□

西安交通大學第二附屬醫院腎病科(西安 710004)

摘要目的：探討六味地黃湯聯合來氟米特、潑尼松對大鼠IgA腎病的作用及其可能的機理。方法：第12周末造模成功后，隨機分為模型對照(M)組、來氟米特和潑尼松(LP)組和中藥(C)組、來氟米特、潑尼松聯合中藥(LPC)組和正常對照(K)組，檢測24小時尿蛋白、尿紅細胞、腎功、血漿白蛋白。腎組織行HE、PAS、P+M及免疫熒光染色；RT-PCR檢測足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin和podocin mRNA的表達。結果：與其他組相比，LPC組尿蛋白、尿紅細胞明顯減少，血清BUN、SCr明顯下降，HE、PAS染色、P+M染色提示腎組織病理損害程度相對較輕，免疫熒光提示腎小球系膜區IgA沉積相對明顯減少，且腎組織nephrin、podocin mRNA表達上調。結論：六味地黃湯聯合來氟米特、潑尼松能夠延緩腎臟損害的進展，其作用機制可能與上調Nephrin、Podocin的表達，抑制系膜細胞增生，減少系膜區免疫復合物沉積有關。

主題詞腎病 動物，實驗大鼠

近年來，IgA腎病在原發性腎小球疾病中所占的比例升高，雖然IgA腎病進展較為緩慢，但仍有15%～25%的患者在10年內進展至終末期腎病[1]。因此，控制IgA腎病的進展、延緩終末期腎病的發生是腎臟疾病治療的主要目的。傳統的西藥對IgA腎病蛋白尿的治療停滯不前，因其嚴重的毒副作用使應用受到一定限制[2-3]。隨著中醫學的發展，中藥的應用越來越多，特別是中西醫結合治療IgA腎病是目前控制IgA腎病進展的最佳方案[4-5]。本研究探討來氟米特、潑尼松聯合中藥六味地黃湯方案對大鼠IgA腎病的作用及其可能的機理。

1材料雌性健康SD大鼠42只，隨機分為正常對照(K)組和模型組，其中正常對照組7只，造模組35只，采用口服免疫原BSA(牛血清白蛋白)皮下注射四氯化碳，并聯合運用LPS(脂多糖)尾靜脈注射制造IgA腎病模型[6]。

2實驗方法2.1藥物第12周末分別在正常對照組和造模組隨即選取大鼠處死，留取腎組織標本，并初步驗證造模成功后，剩余造模大鼠隨機分為模型對照(M)組、來氟米特+潑尼松(LP)組和中藥(C)組、來氟米特+潑尼松+中藥(LPC)組，并分別給予等量生理鹽水、來氟米特+潑尼松混懸液、中藥湯劑、來氟米特+潑尼松混懸液+中藥湯劑灌胃，潑尼松按3mg /kg/d給藥，來氟米特按10mg/kg/d給藥，中藥方劑在六味地黃湯基礎上加減化裁而成，組方包括：黃芪60g，丹參30g，生地、熟地各30g，山藥、山萸肉、丹皮、茯苓、澤瀉、枸杞子、菟絲子各12g，焦三仙(焦麥芽、焦山楂、焦神曲)各12g，二冬(天門冬、麥門冬)各12g，甘草6g。

2.2檢測項目定期收集大鼠尿標本檢測尿紅細胞尿蛋白。第18周末實驗結束后處死大鼠，收集大鼠血標本檢測腎功、血漿白蛋白，取腎組織液氮處理后置于-80℃冰箱保存，分別做普通光鏡HE、PAS染色、P+M染色及免疫熒光染色和RT-PCR檢查。普通光鏡下觀察病理情況，免疫熒光染色觀察腎小球系膜區IgA沉積情況，RT-PCR檢查腎臟足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin和podocin mRNA(NPHS1、NPHS2)表達。Nephrin(NPHS1)和podocin(NPHS2)引物設計與合成據Genebank查詢結果得到，序列如下：Sequence Name:NPHS1(230bp)； Forward Primer: 5-GCGTCAGCATCAGCAGCAAC-3； Reverse Primer: 5-CAGCACATTGAAGCGGTAGAAGG-3。(2)Sequence Name:NPHS2(167bp)； Forward Primer: 5-GGATGGCGGCTGAGATTCTGTC-3； Reverse Primer: 5-GATGCTTCCTTGTGCTCTGTTGC-3。

2.3統計學方法各檢測結果用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗法，數據用SPSS18.0統計軟件處理，P<0.05認為數據間的差異有統計學意義。

3結果3.1 模型驗證實驗第12周末，隨機抽取的造模大鼠24小時尿蛋白(38.70±2.74 mg)明顯高于正常對照組(2.88±2.09 mg)，差異具有統計學意義(P<0.05)。疫熒光示造模組各大鼠大部分腎小球系膜區IgA團塊狀沉積，而正常對照組未見上述改變，進一步驗證造模成功。

3.2治療后各組24小時尿蛋白定量、血尿的變化經治療6周后，與M組比較，尿蛋白、尿紅細胞在各治療組均有下降，除 C組治療效果稍差，其余各組均有統計學差異(P<0.05)；與其余各組比較，LPC組尿蛋白下降最為明顯(P<0.05)，但LPC組尿紅細胞與LP組無統計學差異(P>0.05)，與C組比較差異有統計學意義(P<0.05)；LP組與C組之間比較，LP組較C組效果更明顯，兩指標差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

3.3各組血漿白蛋白、尿素氮、肌酐的變化經治療6周后，與M組相比，其余各組血漿白蛋白升高，尿素氮、血肌酐下降，其中C組治療效果稍差，與M組比較除尿素氮有統計學差異外(P<0.05)，其余兩指標均無統計學意義(P>0.05)；LPC組與其余各組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)見表2。

3.4RT-PCR檢測腎組織Nephrin和Podocin的表達將PCR產物帶用凝膠圖像處理軟件進行條帶半定量分析，轉化成數值型變量。以GADPH為內參，NPHS1/GADPH、NPHS2/GADPH計算nephrin和podocin的mRNA的相對表達量，如下表3。研究發現聯合治療組比兩單藥使用，具有更明顯的上調nephrin、podocin mRNA的作用(p<0.05)，見圖1。

圖1各組大鼠腎組織Nephrin和Podocin mRNA表達

3.5各組大鼠腎臟病理學檢測①HE染色M組可見系膜細胞及基質中度增生，炎性細胞浸潤，腎小球基底膜增厚，小血管硬化，管腔變窄，C組病變較M組稍輕，LP組及LPC組病理損傷程度明顯減輕，系膜細胞及基質輕度增生，LPC組療效最佳，空白對照組未見上述明顯變化，見圖2。

②PAS染色 M組看見腎小球系膜細胞和基質明顯增生，腎小球體積輕度增大，部分球囊粘連，C組病理損害稍輕，LP組和LPC組較前兩組明顯好轉，腎小球增生程度減輕，腎小球基底膜完整，其中LPC組病理損害最輕。正常腎小球未見上述變化，見圖3。

③ P+M染色M組看見腎小球系膜細胞和基質明顯增生，腎小球腫脹，可見上皮下嗜復紅蛋白沉積，C組病理損害稍輕，LP組和LPC組較前兩組明顯好轉，腎小球增生程度減輕，腎小球基底膜完整，未見嗜復紅沉積物，其中LPC組病理損害最輕。正常腎小球未見上述變化，見圖4。

④IgA免疫熒光強度比較：M組腎小球系膜區可見免疫熒光團塊樣沉積，C組較M組稍弱，LP及LPC組熒光較暗，強度較弱，正常對照組無或僅有少量免疫復合物沉積，并對熒光強度進行分析。M組與正常組有顯著差異，LP組與模型組比較有顯著差異，LPC組與模型組、C組有顯著差異。見表4。

注：(-)表示陰性；(±)表示高倍鏡下似乎可見；(+)表示低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下明顯可見；(++)表示低倍鏡下明顯可見，高倍鏡下清晰可見；(+++)表示低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼；(++++)表示低倍鏡下耀眼，高倍鏡下不刺眼。

4討論自IgA腎病發現以來，對其研究越來越多，但至今本病的發病機制仍不甚清楚。IgA腎病臨床表現多樣，病理類型復雜，治療存在諸多困難。現有的研究表明激素能夠減輕蛋白尿，減少發展至終末期腎病的風險，但其對腎臟的保護作用還不是很清楚[7-8]。意大利的一組調查研究顯示，激素有10年的后續治療效果，可明顯減輕尿蛋白，延緩腎臟病的進展[9]。然而大劑量激素可能導致嚴重的毒副作用。而最新隨機對照研究發現，激素僅能適度減輕蛋白尿，并不能保護腎小球濾過率[10-11]。我們通常認為，尿蛋白量>1g/24h的患者需使用糖皮質激素，加用大劑量ACEI/ARB控制血壓，保護腎臟功能[12]。國內張虹等[13]選取31例原發性IgA腎病患者，用來氟米特聯合小劑量激素進行治療，療程3個月，結果發現表現為單純發作性血尿和鏡下血尿，病理積分較少者療效較好，對于臨床表現為大量蛋白尿或腎病綜合征者療效較差，治療過程中有4例出現來氟米特相關副作用。因此，我們需一種藥物，能夠減輕激素及其他免疫抑制劑的毒副作用，并能進一步加強其治療作用，而我們的中藥方劑就是此類藥物之一。陳淑娟等[14]發現中藥聯合替米沙坦治療IgA腎病療效顯著，改善患者臨床癥狀，保護腎功能，延緩IgA腎病的進展。IgA腎病多以氣陰兩虛者多見，蛋白尿的發生多數以肝腎陰虛為常見癥候群。六味地黃湯具有益氣養陰、滋補肝腎、清熱涼血等功效，其治療腎臟疾病歷史悠久，本方劑是在六味地黃湯基礎上加減多味中藥而成，對氣陰兩虛、肝腎陰虛者，尤為有效。近年來六味地黃湯對糖尿病腎病大鼠治療效果文獻報道較多，但對IgA腎病的作用研究較少，本實驗通過基礎實驗研究，進行嚴格的對比觀察，證明了六味地黃湯在治療IgA腎病上的功效[15]。

本研究發現中藥組雖然能減輕蛋白尿，減少系膜區IgA沉積，穩定腎功能，但與模型組相比除尿素氮外其余各項均無統計學差異，提示其單獨使用中藥六味地黃湯對IgA腎病的治療作用較弱。但來氟米特、潑尼松聯合中藥六味地黃湯能夠明顯降低IgA腎病大鼠蛋白尿，改善腎功能，認為IgA腎病的發病可能與nephrin、podocin分子表達異常導致腎臟濾過屏障損傷，尿蛋白產生、腎功能損害關系密切[16-17]。從病理上，我們觀察到LPC組除系膜細胞增生減輕，系膜區免疫復合物沉積減少外，同時腎小球毛細血管管壁與血管周徑之比明顯小于LP組，其機制可能與中藥具有保護內皮、抗動脈粥樣硬化等有關。中藥方劑中所含的黃芪、丹參等中藥可以減少內皮細胞釋放血漿血栓素、內皮素和一氧化氮，提高內皮細胞存活率及SOD活性，降低乳酸脫氫酶活性等，達到保護血管內皮的作用，還可以通過抑制內源性膽固醇的合成，抗脂蛋白的氧化，抑制單核細胞趨化蛋白-1，對抗H2O2誘導的平滑肌細胞凋亡，抑制平滑肌細胞增殖相關基因c-myc表達等作用[18-19]。

綜合分析，潑尼松、來氟米特聯合中藥六味地黃湯通過不同靶點藥物的協同作用，達到更好的治療IgA腎病的效果。實驗過程中未發生嚴重的不良作用。可能為臨床中西醫聯合治療IgA腎病提供理論依據，并為其他免疫抑制劑聯合中藥治療IgA腎病的研究提供一定的啟發。

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(收稿2015-11-23；修回2015-12-25)

通訊作者□

【中圖分類號】R573

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.03.051

*陜西省自然科學基金資助項目(2015JM8429)

△延安大學附屬醫院消化內科(延安 716000)

▲西安市第四醫院腎內科(西安 710004)