基因芯片技術在動物疫病診斷中的應用

王偉杰

(洛陽市吉利區動物疫病預防控制中心,河南洛陽 471012)

基因芯片技術在動物疫病診斷中的應用

王偉杰

(洛陽市吉利區動物疫病預防控制中心,河南洛陽 471012)

基因芯片技術是20世紀90年代發展起來的一門高新技術,具有高通量、靈敏度高,特異性好等特點。它是通過微陣列技術,將高密度DNA片段陣列,通過點樣或原位合成法的形式,以一定的順序或者排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面,借助堿基互補雜交原理,進行大量病原基因表達系譜分析、檢測、基因分型等。本文簡要介紹了基因芯片技術在動物疫病診斷中的應用及其發展前景。

基因芯片;動物疫病;診斷

1 基因芯片技術概述

基因芯片，又稱DNA 芯片，屬于生物芯片中的一種，是綜合微電子學、物理學、化學及生物學等高新技術，把大量DNA 探針或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龍膜等載體上，形成的致密、有序的DNA 分子點陣，因固相載體常用硅玻片或硅芯片，故稱之為基因芯片。基因芯片技術的基本原理是分子生物學中的核酸分子原位雜交技術：將短鏈核酸分子固定在固相載體上作為探針，待分析樣品經過標記后與固定在芯片上的探針雜交。基因芯片技術的分類方法很多，最常用的是按載體上所點探針的長度分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片。根據芯片的功能可以分為基因表達譜芯片和DNA測序芯片；根據載體也可分為液相芯片、固相芯片。無論哪種芯片，其技術流程主要包括芯片的制備、待測樣本的制備和標記、雜交反應、結果檢測和數據處理分析等。與傳統的核酸印跡雜交技術相比，基因芯片具有可信度高、信息量大、操作簡單、重復性強以及可以反復利用等諸多優點。

2 基因芯片技術在動物疫病診斷中的應用

2.1 基因芯片技術在豬疫病診斷中的應用

豬傳染病中，多種病原體混合感染極其常見，檢測其病原微生物就顯得尤為重要。張煥容等制備偽狂犬病病毒、豬細小病毒和流行性乙型腦炎病毒檢測基因芯片。選定靶基因最佳點樣質量濃度為200 mg/L，用基因芯片點樣儀將其點制在氨基化基片上。結果表明，探針最佳使用質量濃度為3 000 μg/L，芯片系統檢測靈敏度可3μg/L。姜永厚等建立一種可同時檢測區分豬瘟病毒，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬圓環病毒2型的核苷酸基因芯片方法，針對每種病毒設計了4-6條寡核苷酸探針。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法對76個仔豬樣本進行了檢測，其中25個樣本（32.9%）同時感染了2種以上病毒。符芳等用豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環病毒2型的特異cDNA片段作為探針制備的cDNA微陣列芯片，可以用微量病豬全血一次同時快速、準確地對上述5種病毒進行特異性檢測，展示了基因芯片技術在動物疾病診斷與防制上有著極高的應用價值。楊若松等建立豬瘟病毒、高致病性豬藍耳病病毒、豬圓環病毒2型及豬細小病毒的基因芯片檢測方法，該方法對臨床150份樣品的檢測結果顯示，CSFV陽性樣品有25份．高致病性PRRSV陽性樣品有45份，PCV-2陽性樣品有70份，PPV的檢測結果全部為陰性，其中混合感染樣品有18份。結果表明該法具有良好的特異性、敏感性和重復性。肖國生等利用胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌的7個從3種病菌基因組中擴增出不同特異性靶DNA制作基因芯片．并對芯片的靶DNA和探針濃度、雜交溫度、重復性、特異性和靈敏度進行了研究。試驗結果證明，其所研制的基因芯片特異性強、靈敏度高能檢測到10～50 pg基組DNA，且芯片可重復利用，是一種能有效用于胸膜肺炎放線桿菌、豬多殺性巴氏桿菌和豬肺炎支原體鑒定和聯合檢測的新工具。

2.2 基因芯片技術在禽病診斷中的應用

基因芯片技術也應用于禽的一些常見傳染病的診斷上。田麗娜等將克隆和鑒定的AIV的HA、NA、M、NS、NP基因以及NDV、IBDV 、IBV的保守基因片段作為探針，同時以克隆的GAPDH基因作為陽性對照，利用芯片點樣系統SpotArray-TM24將探針與陽性對照、陰性對照和空白對照按照設計好的陣列點在基片上，制備了AIV等RNA病毒芯片，該方法對20份已鑒定的H5N1亞型禽流感病毒的檢出率為100%（20/20）；10份送檢的疑似AIV樣品的檢出率為70%（7/10），檢測結果與RT-PCR和雞胚傳代分離鑒定的符合率為100%。結果表明，制備的DNA芯片可有效診斷禽流感等病毒。韓雪清等根據Genbank上已發表的禽流感病毒不同亞型的基因序列，設計合成了25 對特異性引物和1對通用引物，然后以各亞型病毒的參考株RNA作為模板，建立擴增不同亞型的多重RTPCR方法。參考各亞型病毒靶cDNAs區域的保守序列設計了52條亞型特異 的探針。在此基礎 上，將設計好的探針點制到處理好的玻片上，制備了禽流感病毒分型鑒定基因芯片，結合所建立的擴增不同亞型的多重RT-PCR方法，開發了禽流感病毒亞型鑒定基因芯片試劑。利用收集自49個地區的2653份標本對其特異性和敏感性進行了初步評價。證明該病毒分型基因芯片具有良好的特異性、敏感性。

3 結論及展望

隨著芯片技術研究的不斷深入，它在醫學、分子生物學領域應用越來越廣泛，受到人們的普遍重視，已呈現出廣闊的應用前景和商業前景。目前，人醫已有10余個應用芯片技術開發的檢測試劑盒被政府批準使用。隨著基因芯片技術不斷發展完善，它將會成為一種更快速、準確和簡便的動物傳染病診斷方法。在不久的將來，基因芯片技術將為動物傳染病的診斷提供一個重要的研究和應用平臺。

[1] 葉芬，蔡家利.基因芯片技術在豬病毒性疾病診斷中的應用[J].動物醫學進展，2010，（7）：87-89．

[2] 張煥容，曹三杰，文心田，等.偽狂犬病病毒、豬細小病毒和流行性乙型腦炎病毒檢測基因芯片的制備[J].中國獸醫學報，2007，27（5）：667-670.