升紅顆粒質量標準研究

廖曾珍　鄧俊剛　李　江　鄧　航　付　翔　毛柳珺　甘潔靜　林家怡

桂林醫學院附屬醫院藥學部，廣西　桂林　541001

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升紅顆粒質量標準研究

廖曾珍鄧俊剛李江*鄧航付翔毛柳珺甘潔靜林家怡

桂林醫學院附屬醫院藥學部，廣西桂林541001

【摘要】目的：建立升紅顆粒的質量控制標準。方法：采用薄層色譜法(TLC)對制劑中雞血藤、花生紅衣進行定性鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)對制劑中兒茶素進行含量測定。色譜柱：SEPAX Amethyst C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：水-甲醇-乙腈-冰醋酸(90∶5∶5∶0.4)；流速：0.8ml/min；檢測波長：280nm；柱溫：35℃。結果：TLC譜斑點清晰，分離度良好，陰性對照無干擾。兒茶素進樣量在0.0982～3.9269μg范圍內與其峰面積積分值呈良好的線性關系(r=0.9999)；平均加樣回收率為92.32%，RSD=2.72%(n=6)。結論：該方法簡便、快捷、重現性好,可用于升紅顆粒的質量控制。

【關鍵詞】升紅顆粒；質量標準；薄層色譜法；兒茶素；高效液相色譜法

升紅顆粒是根據我院腫瘤科臨床驗方開發的純中藥復方制劑，由雞血藤、花生紅衣、大棗、枸杞子4味藥材制成，具有活血補血、健脾養血、滋補肝腎的功效，臨床用于治療腫瘤患者化療所致的血小板、白細胞減少等癥。研究證實，方中的雞血藤[1]、花生紅衣[2]均含有刺激造血祖細胞增殖的兒茶素類成分，且雞血藤的黃酮類成分還具有促進血虛動物模型造血功能[3]。研究采用薄層色譜法對制劑中的雞血藤、花生紅衣進行鑒別,采用HPLC法對制劑中兒茶素進行含量測定,取得了滿意的效果。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent HP1100系列高效液相色譜儀(包括Agilent G1310A單元泵、Agilent G1316A柱溫箱、Agilent G1314A可變波長檢測器，美國Agilent公司) ；威瑪色譜工作站；B2500S-MT型超聲波清洗器 (必能信超聲上海有限公司)；FA2004電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；

1.2材料升紅顆粒(批號: 141010、141018、141027，自制)；兒茶素對照品(批號：110877-201203)、芒柄花素對照品(批號：111703-200603)、雞血藤對照藥材(批號：121173-201103)、花生紅衣對照藥材(批號：121491-200401)均由中國食品藥品檢定研究院提供;甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純;高效硅膠G薄層板(10cm×10cm，青島海洋化工廠)。

2方法與結果

2.1TLC鑒別

2.1.1雞血藤的TLC鑒別[4-5]取本品3.0g，加二氯甲烷25ml，浸泡30min后，超聲 (功率：100W；頻率：40kHz)處理 20min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇5ml使溶解，搖勻，作為供試品溶液。另取芒柄花素對照品適量，加甲醇制成每1ml含0.5mg芒柄花素的溶液，作為芒柄花素對照品溶液。另取雞血藤對照藥材2.0g，照上述供試品溶液的制備方法制成雞血藤對照藥材溶液。按處方量稱取不含雞血藤的其他飲片各適量，照升紅顆粒的制備方法，制成缺雞血藤陰性樣品，取缺雞血藤陰性樣品3.0g，照上述供試品溶液的制備方法制成缺雞血藤的陰性樣品溶液。按照2010年版 《中國藥典》(一部) 附錄VIB的薄層色譜(TLC)法試驗，吸取上述4 種溶液各10μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-石油醚-甲醇(5∶15∶1) 為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm 紫外光燈下檢視。結果供試品色譜中在與對照品色譜及對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照色譜無相應的斑點。見圖1。

2.1.2花生紅衣的TLC鑒別[6]取本品3.0g，加乙酸乙酯25ml，浸泡30min后，超聲 (功率：100W，頻率：40kHz) 處理20min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇5ml使溶解，搖勻，作為供試品溶液。另取花生紅衣對照藥材2.0g，照上述供試品溶液的制備方法制成花生紅衣對照藥材溶液。按處方量稱取不含花生紅衣的其他飲片各適量，照升紅顆粒的制備方法，制成缺花生紅衣陰性樣品，取缺花生紅衣陰性樣品3.0g，照上述供試品溶液的制備方法制成缺花生紅衣陰性樣品溶液。按照2010年版 《中國藥典》(一部) 附錄VIB的薄層色譜法試驗，吸取上述3 種溶液各10μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸(8∶3∶1∶2) 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，放冷，置日光下檢視。結果供試品色譜中, 在與花生紅衣對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的紫紅色斑點,陰性對照液色譜無相應的斑點。見圖2。

2.2含量測定[7]

2.2.1色譜條件色譜柱：SEPAX Amethyst C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：水-甲醇-乙腈-冰醋酸(90∶5∶5∶0.4)；流速：0.8ml/min；檢測波長：280nm；柱溫：35℃；進樣量：20μl。

2.2.2對照品溶液的制備取兒茶素對照品適量，精密稱定，置于量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.9817mg的溶液，即得。

2.2.3供試品溶液的制備取樣品研細，精密稱定約1g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，稱定質量，浸泡30min后，超聲(功率：100W，頻率：40kHz)處理20min，放冷，再次精密稱定，加50% 甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4陰性樣品溶液的制備取缺雞血藤和花生紅衣的陰性樣品適量，按“2.2.3”項下方法制成陰性樣品溶液，即得。

2.2.5系統適用性試驗取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各20μl，分別按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，色譜峰基線平穩，供試品溶液中兒茶素與其它組分分離度良好，陰性無干擾；理論塔板數按兒茶素峰計算應不低于4000，分離度>1.5，拖尾因子：0.96。色譜見圖3。

2.2.6線性關系考察精密量取“2.2.2”項下的兒茶素對照品溶液適量，加甲醇依次稀釋成質量濃度分別為0.0049、0.0098、0.0196、0.0491、0.0982、0.1963mg/ml的溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量 (x，μg) 為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=666049x-23116(r=0.9999)。結果表明，兒茶素的進樣量在0.0982～3.9269μg范圍內與其峰面積的積分值呈良好的線性關系。

2.2.7精密度實驗精密吸取“2.2.6”項下質量濃度為0.0491mg/ml的兒茶素對照品溶液20μl，按“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積。結果，兒茶素峰面積的RSD為0.98%，表明儀器精密度良好。

2.2.8穩定性實驗取同一供試品溶液適量，分別于制備0、1、2、4、6、8h時，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，兒茶素峰面積的RSD為2.46%，表明供試品溶液在8h內穩定性良好。

2.2.9重復性實驗取同一批次(批號:141010)升紅顆粒1g，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算峰面積，并計算樣品含量。結果，兒茶素的平均含量為0.9255mg/g，RSD為1.13%，表明本方法重復性良好。

2.2.10加樣回收率實驗精密稱取已知兒茶素含量(0.9255mg/g)的升紅顆粒(批號: 141010) 1.0g，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入兒茶素對照品溶液(1.0012mg/ml)0.9ml，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定， 記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1　加樣回收率試驗結果(n=6)

2.2.11樣品含量測定取3批樣品各適量，分別按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，結果見表2。

表2　樣品含量測定結果(n=3)

3討論

3.1花生紅衣的薄層色譜鑒別考察花生紅衣的薄層色譜鑒別方法時，參照文獻[6]的方法，但該方法制備供試品須經水煎煮提取、酸化及乙酸乙酯萃取等操作過程，比較繁瑣費時，因此直接用乙酸乙酯進行超聲提取，實踐證明改進后的方法不僅操作簡便，而且斑點清晰，分離效果同樣比較理想。另外，原方法采用的展開劑為甲苯-丙酮-乙酸(3∶3∶1)，考慮到甲苯毒性較大，對環境和實驗人員健康的影響較大，因此嘗試用極性相似的溶劑系統進行替代。實驗考查了二氯甲烷-甲醇-乙酸(8∶1∶1.5、5∶1∶1、3∶1∶1)及二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸(8∶3∶1∶2、8∶6∶1∶2.5)等系統，結果以二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸(8∶3∶1∶2)的展開效果比較理想，斑點清晰，Rf值適中。

3.2HPLC法測定兒茶素含量HPLC法測定升紅顆粒中兒茶素含量的色譜條件借鑒了本課題的前期研究中摸索出的HPLC法測定花生紅衣中兒茶素含量的色譜條件[8]，經驗證，該條件同樣適合升紅顆粒中兒茶素含量的測定，分離度、脫尾因子均符合要求。

在研究供試品的制備條件時，提取溶劑分別考察了水、乙醇、50%甲醇、50%乙醇等溶劑的提取效果，提取方法考察了回流提取(1、1.5、2h)及超聲提取(20、30min)。結果以先用50%甲醇浸泡30min后，再超聲提取20min的方法比較好，操作簡便且兒茶素提取比較完全。

3.3由于本制劑制備的批次較少，隨著投料量的變化和制備工藝的改進，兒茶素的含量仍不穩定，需穩定工藝后進一步積累數據，以確定兒茶素的含量限度，才能用于本制劑的質量控制。

參考文獻

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[8]蔣文玉，李江，鄧俊剛，等. 高效液相色譜法測定花生紅衣中兒茶素的含量[J].華夏醫學，2014，27(6)：11-13.

Study on quality standard of Shenghong Granules

LIAO ZengzhenDENG JungangLI Jiang*DENG HangFU XiangMAO LiujunGAN JiejingLIN Jiayi

Department of Pharmacy，The Affiliated Hospital of Guilin Medical university，Guilin 541001，China

Abstract:Objective To establish the quality standard of Shenghong granules. Methods Spatholobi Caulis and Testa Arachis in formulation were qualitatively identified by TLC，and the content of catechin was determined by HPLC. The determination was performed on SEPAX Amethyst C18column with mobile phase consisted of water-methanol-acetonitrile- glacial acetic acid (90∶5∶5∶0.4)at the flow rate of 0.8 ml/min.The detection wave length was set at 280 nm，and column temperature was 35℃. Results The TLC spots were fairly clear and well-separated，and the negative control showed no interference. The catechin showed a good linear relationship at a range of 0.0982-3.9269μg,(r=0.9999). The average recovery was 92.32%, and RSD was 2.72 %(n=6). Conclusions The established methods are simple, quick and good reproductive，and can be used for the quality control for Shenghong Granules.

Key words:Shenghong granules; quality standard; TLC；catechin；HPLC

(收稿日期：2015.12.20)

【中圖分類號】R286

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)03-0014-03

作者簡介：廖曾珍(1982-),女,廣西桂林人，主管藥師,主要從事中藥制劑研究和醫院藥學工作。通信作者：李江(1970-)，男，四川金堂人，主任藥師，主要從事中藥新藥研究開發和醫院藥學工作。

基金項目：廣西壯族自治區衛生廳中醫藥科技專項(合同編號：GZYZ1224)。