廣豆根總黃酮的超聲提取工藝及抗氧化活性

蘭艷素， 王愛東， 牛江秀（黃山學院化學化工學院，安徽黃山245041）

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廣豆根總黃酮的超聲提取工藝及抗氧化活性

蘭艷素， 王愛東， 牛江秀
（黃山學院化學化工學院，安徽黃山245041）

摘要：目的 以廣豆根為原料，利用星點設計-響應面法研究其中總黃酮的超聲提取工藝，然后進行抗氧化活性測試。方法 以乙醇體積分數、超聲提取時間、液料比為考察因素，進行3因素5水平星點試驗設計，響應面分析法優化廣豆根中總黃酮的提取工藝，DPPH法研究純化前后總黃酮的自由基清除能力。結果 最佳工藝為乙醇體積分數80%，提取時間30 min，液料比20∶1（mL/g）。在此條件下，黃酮得率為12.71 mg/g，與模型預測值相符。而且，純化前后的廣豆根總黃酮對DPPH自由基均具有較強的清除能力。結論 該工藝簡單、可行，而且總黃酮提取物具有明顯的抗氧化活性，是一種天然的抗氧化劑。

關鍵詞：廣豆根；總黃酮；超聲提取；星點設計-響應面法；抗氧化活性

廣豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根及根莖，是清熱解毒、利咽消腫的傳統中藥［1］，臨床上經常用于治療咽喉炎、心律失常和黃疸等病癥［2］，含有黃酮、生物堿、三萜、甾醇［3］以及微量元素［4］等成分，前期已對其中的化學成分進行分離，結果首次從中分離得到10個已知黃酮類化合物［5］以及1個新黃酮類化合物［6］。據報道，很多藥材中均含有黃酮類化合物，是常見的藥效成分之一，具有很多的藥理活性，如抗病毒、抗氧化等，還可有效改善血管的滲透性［7］。因此，從廣豆根中提取總黃酮具有很好的應用前景。

星點設計是一種能將數學和統計方法融于一體的新型試驗方法，既能克服正交試驗設計精度不夠、操作繁瑣等缺陷，而且對實驗結果的預測性較好［8］，故常被應用于中藥有效成分（黃酮、生物堿、皂苷、三萜類等）的提取工藝、處方優化等領域［9-10］。本實驗采用超聲法輔助提取，星點設計-響應面法優化廣豆根中總黃酮的提取工藝，并探討其抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料 廣豆根采自安徽嶺南自然保護區，經黃山學院生命與環境科學學院方建新老師鑒定為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根及根莖。蘆丁對照品（批號10080-200707，中國食品藥品檢定研究院）；DPPH· （1，1-二苯基苦基苯肼，美國）。乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、抗壞血酸均為分析純。

1.2 儀器 UV-2600紫外可見分光光度計（日本島津公司）；KQ-300VDV超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG-165臺式高速離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 廣豆根中總黃酮提取工藝流程 廣豆根→60℃烘干→粉碎→80%乙醇浸泡0.5 h→超聲波提取→冷卻→離心15 min→總黃酮提取物。

1.3.2 標準曲線的制作 精密稱取12.3 mg蘆丁對照品，烘箱中干燥12 h，完全溶解后定容于50 mL量瓶中，即得蘆丁對照品溶液。參考文獻［11］中的紫外分光光度法，并略做改動。移取不同體積的蘆丁對照品溶液，依次加入NaNO2、A1（NO3）3和NaOH溶液進行顯色，空白溶液調零，在510 nm波長處測定吸光度（A）值，得標準曲線方程A＝10.107χ＋0.045 9，R2＝0.999 5，表明線性關系達到試驗要求。

1.3.3 廣豆根總黃酮的提取及含量測定 稱取1.0 g干燥的廣豆根粉末，轉移至100 mL圓底燒瓶中，按試驗設計加入一定體積分數的乙醇溶液，接上冷凝回流裝置，浸泡0.5 h，超聲（300 W、45 Hz）輔助提取一定時間。樣品溶液經過冷卻、離心后，移取上層清液7 mL，適當稀釋，然后按“1.3.2”項下方法進行顯色操作，最后紫外分光光度計測定溶液的吸光度值，代入標準曲線方程，計算總黃酮含有量，從而得到其提取率，公式如下。

其中，C為稀釋后溶液的黃酮質量濃度（mg/mL）；M為樣品質量（g）；V為離心后的上層溶液體積（mL）；N為稀釋的倍數。

1.4 單因素試驗 稱取干燥的廣豆根粗粉1.0 g，共19份，分別轉移至100 mL圓底燒瓶中，依次以乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（mL/g，10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1）、提取時間（10、15、20、25、30、35、40 min）為因素，在50℃提取溫度下超聲（300 W、45 Hz）提取，提取液經冷卻、離心、稀釋等處理后，按照“1.3”項下方法測定溶液吸光度值，考察以上3個因素對總黃酮提取率的影響。

1.5 方法學考察

1.5.1 精密度試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液1.0 mL，按照“1.3”項下方法顯色后，測定溶液吸光度值。結果，ISD為0.95%（n＝5），表明儀器精密度良好。

1.5.2 穩定性試驗 吸取稀釋好的黃酮溶液5.0 mL，顯色后每隔20 min測定一次溶液的吸光度值。結果，ISD 為1.16%（n＝9），表明樣品溶液在3 h內測定穩定性較好。

1.5.3 重復性試驗 稱取廣豆根粗粉1.0 g，在優化后的提取工藝條件下提取，提取液按“1.3”項下方法測定總黃酮的含有量，平行5次。結果，ISD為0.85%，表明該方法重復性良好。

1.5.4 加樣回收率試驗 精密量取5份在最優提取工藝條件下的提取液（總黃酮質量濃度為0.635 5 mg/mL），分別加入等體積蘆丁溶液，依次加樣后顯色，測定溶液吸光度。結果，平均回收率為98.86%，ISD為1.08%，表明該方法回收率良好。

1.6 星點設計 綜合考慮單因素試驗結果，固定超聲功率為300 W，頻率為45 Hz，以乙醇體積分數、提取時間和液料比為考察因素，總黃酮提取率為響應值，進行星點實驗設計，各因素分別用X1、X2、X3表示，結果見表1。

表1 星點設計因素與水平

1.7 廣豆根總黃酮的抗氧化活性測定 精密稱取冷藏避光存放的DPPH·固體19.9 mg，迅速用80%乙醇溶解，定容于250 mL棕色量瓶中，得到質量濃度為0.2 mo1/L的DPPH·溶液，避光冷藏保存。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對廣豆根總黃酮提取率的影響 見圖1。

圖1 乙醇體積分數對廣豆根總黃酮提取率的影響

由圖可知，乙醇體積分數在60%～80%之間時，總黃酮提取率的變化非常明顯，可能是因為該類成分大多為中、低極性；在80%時，總黃酮提取率最高，可達14.82 mg/g；在40%時，提取率最低，只有12.95 mg/g，最大值與最小值相差較大，表明乙醇體積分數對提取效果的影響相對較大。因此，確定乙醇體積分數為80%。

2.1.2 提取時間對廣豆根總黃酮提取率的影響 見圖2。

圖2 提取時間對廣豆根總黃酮提取率的影響

由圖可知，當提取時間為10 min時，總黃酮得率最低，為12.74 mg/g；隨著提取時間延長，得率緩慢增加；在30 min以后，曲線變平緩，而且稍有下調，可能是因為提取的時間過長會對黃酮成分的結構造成一定破壞。因此，確定提取時間為30 min。

2.1.3 液料比對廣豆根總黃酮提取率的影響 見圖3。

圖3 液料比對廣豆根總黃酮提取率的影響

由圖可知，液料比在10∶1到15∶1（mL/g）之間的曲線較陡峭，總黃酮得率變化明顯，說明加大溶劑量可較好地促進總黃酮的溶出；若液料比繼續擴大，總黃酮量變化甚微，曲線不再上揚；當液料比為20∶1（mL/g）時，提取率最高。因此，確定液料比為20∶1（mL/g）。

2.2 設計試驗與結果 見表2。

2.2.1 模型擬合 采用Design Expert軟件，對試驗數據進行分析，得到超聲提取廣豆根總黃酮的回歸方程為Y＝12.75 -0.323 8X1＋0.070 6X2-0.254 6X3＋0.152 5X1X2-0.16X1X3＋0.342 5X2X3-0.800 4X21-0.347 8X22-0.561 7X23。然后，對其進行方差分析，結果見表3。

由表可知，X1和X3對總黃酮提取率的影響非常顯著；超聲提取時間的P值為0.115 1（＞0.05），說明提取時間對總黃酮得率的影響不顯著；X21、X22、X23的P值都小于0.000 1，影響都非常顯著。同時，液料比和提取時間的交互作用對總黃酮提取率的影響也很顯著，而其余交互作用也有一定影響。

另外，失擬項的P值為0.369 4（＞0.05），影響不顯著，說明試驗所選的3個考察因素為主要影響因素，設計合理；所得模型的F值為82.96，P＜0.000 1，影響非常顯著。因此，該模型優化得到的廣豆根總黃酮提取工藝條件可靠、準確。

表2 試驗設計與結果

表3 方差分析結果

2.2.2 效應面分析 見圖4～6。

圖4可見，提取時間與乙醇體積分數交互影響的響應曲面彎曲明顯，提取時間30 min、乙醇體積分數80%處為曲線最高點。而且，曲線的左側較平緩，說明提取時間對試驗結果的影響較小。

圖5可見，當提取時間固定，液料比在15∶1～25∶1 （mL/g）之間時，黃酮提取率緩慢增大，達到最高點后開始快速下降；當液料比不變，延長提取時間時，其變化不明顯，說明該因素對黃酮得率的影響不如液料比。由此可知，在乙醇體積分數不變，液料比為20∶1（m L/g）的條件下提取30 min時，黃酮提取率最高。

圖6可見，乙醇體積分數與液料比的交互作用曲面非常對稱，而且彎曲度明顯，可見其對廣豆根總黃酮提取率的影響較大。隨著液料比的上升以及乙醇體積分數的增加，曲線先上揚，后下調，當乙醇體積分數為80%，液料比為20∶1（mL/g）時，提取效果最好。

圖4 提取時間與乙醇體積分數交互影響黃酮提取率的響應面圖

圖5 提取時間與液料比交互影響黃酮提取率的響應面圖

圖6 乙醇體積分數與液料比交互影響黃酮提取率的響應面圖

2.3 驗證試驗 考慮到具體實驗操作的可行性，盡可能將模型工藝參數取整修正。稱取6份等質量的廣豆根藥材，在功率為300 W，頻率為45 Hz，提取溶劑為80%乙醇，液料比為20∶1（mL/g）的條件下超聲提取30 min，提取液處理后分別進行顯色，然后測定。結果，總黃酮的平均得率為12.71 mg/g，與模型預測值相差不大，說明該模型可靠，可對廣豆根中總黃酮的提取結果進行很好地預測。

2.4 抗氧化活性評價 按“1.7”項下方法進行試驗，分別考察不同質量濃度（3.76～27.3 μg/mL）總黃酮提取物對DPPH·的清除作用，結果見圖7。

圖7 廣豆根總黃酮對DPPH·的清除作用

由圖可知，廣豆根粗提物對DPPH·具有一定的清除能力，其清除率曲線位于VC之下。總體來看，隨著總黃酮質量濃度的升高，清除能力也隨之增強，呈現一定的線性關系，廣豆根粗提物的線性方程為y＝2.716χ＋7.123 7 （R2＝0.986 1），IC50為15.79 μg/mL；VC的線性方程為y＝2.879 3χ＋19.434（R2＝0.942 7），IC50為10.62 μg/mL，可見總黃酮粗提液對DPPH·的清除能力稍弱于VC，當前者質量濃度大約為后者的1.49倍時，對DPPH·具有同等的抑制能力。同時還發現，經過AB-8大孔樹脂純化后，黃酮提取液的抗氧化活性得到了明顯增強，對DPPH·的清除率稍高于VC，表明安徽嶺南產的廣豆根具有較強的抗氧化活性。

3 結論

預試驗分別采用乙醇回流法和超聲法提取廣豆根中總黃酮，并比較兩者的提取效果。結果表明，超聲提取技術可使總黃酮較好、較快地溶出，具有提取時間短、提取效率高等優點，而且在提取溫度也不高，可盡量避免由于長時間加熱或者高溫對有效成分結構的破壞，故本實驗選用超聲法進行提取。另外，為了減小由于乙醇揮發所帶來的誤差，最好使用帶有冷凝回流的提取裝置。

而且，效應面分析法所得模型的顯著性較高。在選取的3個考察因素中，影響最明顯的是乙醇體積分數，其次為液料比。最優工藝參數為乙醇體積分數80%，提取時間30 min，液料比20∶1（mL/g），該條件下總黃酮得率為12.71 mg/g，方法簡便、可行。

然后，考察在最佳提取工藝條件下得到總黃酮提取物以及經AB-8大孔樹脂純化后的總黃酮對DPPH·的清除能力。結果表明，安徽嶺南產的廣豆根藥材中總黃酮成分對自由基的清除率較高，抗氧化作用較好，研究開發前景可觀。

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作者簡介：蘭艷素（1985—），女，碩士，助教，從事天然產物提取分離與活性研究。Te1：13685595775，E-mai1：1s7536858@163.com

基金項目：安徽高校省級優秀青年人才基金重點項目（2013SQIL088ZD）；安徽省自然科學基金項目（1308085QH139）；黃山學院自然科學基金項目（2011xkj017）

收稿日期：2015-01-28

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.050

中圖分類號：I 284.2

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）03-0698-05