大蒜素聯合5-FU對腺樣囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的抑制作用

車超，吳發印，李華林，周鶴峰

(1.遵義醫學院第五附屬珠海醫院口腔科，廣東珠海519100；2.遵義醫學院珠海校區生物工程系，廣東珠海519041)

·論著·

大蒜素聯合5-FU對腺樣囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的抑制作用

車超1，吳發印1，李華林1，周鶴峰2

(1.遵義醫學院第五附屬珠海醫院口腔科，廣東珠海519100；2.遵義醫學院珠海校區生物工程系，廣東珠海519041)

目的探討大蒜素聯合5-FU對腺樣囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的抑制作用。方法建立ACC-M細胞Balb/c裸鼠肩胛下移植瘤模型30只。造模2周后挑選24只腫瘤大小較均勻的裸鼠隨機分為實驗組(大蒜素組、5-FU組和大蒜素聯合5-FU組)和對照組，各6只。實驗組按照體質量0.01 mL/g腹腔注射大蒜素和5-FU濃度均為20 μg/mL，對照組注射0.9%PBS液，每兩天一次，共3次，末次注射1周后處死動物。測量移植瘤的體積變化，HE染色觀察移植瘤的病理學改變。結果移植瘤體積變化比較結果：各實驗組移植瘤體積明顯縮小，5-FU組體積小于大蒜素組，大蒜素聯合5-FU組與大蒜素組、5-FU組比較差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；鏡下見對照組的癌細胞生長旺盛，異型率高，而各實驗組的腫瘤細胞出現不同程度減少，間質增加，大蒜素聯合5-FU組最為明顯。結論大蒜素和5-FU均能有效抑制ACC-M細胞Balb/c裸鼠移植瘤的生長，且大蒜素聯合5-FU的抑制作用明顯強于大蒜素或5-FU單獨使用。

大蒜素；5-FU；腺樣囊性癌；裸鼠；移植瘤

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)一般發生在口腔頜面部的唾液腺組織中，是一種易復發、易沿神經擴散以及易發生遠處轉移的惡性腫瘤，其對放療和化療的敏感性較低，具有較高的死亡率[1]。常用的化療藥物有5-FU、長春新堿、紫杉醇等，但其對腺樣囊性癌的治療有效率不高，且容易發生耐藥性[2]。近年來的研究表明，大蒜素對各種癌癥具有明顯的抑制作用，已成為近期抗癌研究的熱點[3-6]，且已有研究表明大蒜素和大蒜油均對體外培養的腺樣囊性癌細胞系(ACC-M)具有抑制作用[7-8]。因此大蒜素作為輔助化療藥物既可減輕單純化療藥物對于正常細胞的殺傷，又可增強化療藥物的藥學作用。本研究通過建立ACC-M細胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型，探討大蒜素聯合5-FU對腺樣囊性癌的抑制作用，為進一步拓展其臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物人腺樣囊性癌ACC-M細胞系由武漢大學保藏中心提供；大蒜素注射液和5-FU分別由廣州皖冬生物科技有限公司和上海旭東海普藥業有限公司生產；胎牛血清及DMEM細胞培養液購自凱基公司；BALB/c-nude T淋巴細胞缺陷型小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司。所購30只裸鼠均為雌性，5～6周齡，體質量(18±2)g，健康狀況良好，動物合格證號為No.11401300035243。將其飼養在常規SPF級管理的華中科技大學實驗動物中心的無菌密閉籠具中，確保籠具獨立通風，室溫為18℃～22℃，濕度為50%～80%。

1.2 裸鼠異種移植與藥物干預方式

1.2.1 細胞培養人腺樣囊性癌ACC-M細胞使用含有100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素及10%小牛血清的DMEM培養基，在37°C以及含有5%CO2的條件下培養，2～3 d傳代1次。對數生長期的細胞使用胰酶消化后用培養基終止消化，PBS液洗滌、離心、去除上清，收集細胞。用PBS緩沖液調整細胞濃度為約2×107個活細胞/mL的細胞懸液備用(使用臺盼藍染色確保細胞活力不低于95%)。

1.2.2 裸鼠造模將所購裸鼠飼養1周以適應實驗環境，取前述細胞懸液無菌條件下在30只裸鼠右前肩胛下進行皮下注射接種，每只0.2 mL。接種后2周可見腫瘤生長，呈結節性、膨脹性生長，質硬。

1.2.3 模型分組與藥物干預造模2周后挑選24只腫瘤大小較均勻的裸鼠隨機分為4組(對照組、大蒜素組、5-FU組和大蒜素聯合5-FU組)，每組6只。對照組注射0.9%PBS，實驗組注射的大蒜素和5-FU濃度均為20 μg/mL，每只裸鼠按照體重腹腔注射藥物0.01 mL/g，每2 d注射一次，共注射3次。末次注射一周后拉頸處死裸鼠，取出完整腫瘤組織。

1.3 計算瘤體積給藥前及末次給藥后1周，用游標卡尺測量瘤體長徑(a)和短徑(b)以計算瘤體積(tumor volume，TV)：TV=ab2/2。

1.4 抑瘤率抑瘤率=(1-實驗組平均瘤體積/對照組平均瘤體積)×100%。抑瘤率＞40%說明有抑制作用。

1.5 HE染色組織病理學觀察將手術分離的腫瘤組織以10%甲醛固定，24 h后進行石蠟包埋，4 μm連續切片，HE染色，在光鏡下觀察各組腫瘤組織的形態結構變化。

1.6 統計學方法所有數據用SPSS17.0統計軟件包處理。采用均數±標準差(±s)表示移植瘤體積，抑瘤率以百分比表示，組間兩兩比較采用方差分析，校驗水準：α=0.05，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 計算平均瘤體積和抑瘤率第一次給藥前(TV1)對照組、大蒜素組、5-FU組、大蒜素聯合5-FU組的平均瘤體積比較，差異無統計學意義(P=0.161＞0.05)。末次給藥后，1周大蒜素組、5-FU組、大蒜素聯合5-FU組平均瘤體積明顯小于對照組(P＜0.01)；聯合用藥組小于大蒜素組(P＜0.01)、小于5-FU組(P＜0.05)；5-FU組小于大蒜素組(P＜0.01)(表1)。大蒜素、5-FU單獨使用以及大蒜素聯合5-FU對裸鼠體內ACC-M細胞移植瘤的生長均有明顯的抑制作用，且大蒜素聯合5-FU的抑制作用明顯強于大蒜素或5-FU單獨使用。

表1 各組移植瘤的體積變化及抑瘤率(±s)

表1 各組移植瘤的體積變化及抑瘤率(±s)

注：TV1各組平均瘤體積比較，P＞0.05；TV2各實驗組與對照組比較，aP＜0.01，與大蒜素組比較，bP＜0.01，與5-FU組比較，cP＜0.05。

組別只數平均瘤體積(TV，mm3)抑瘤率(%) TV1TV2對照組大蒜素組5-FU組大蒜素聯合5-FU組6666 47.64±7.42 56.59±10.41 58.10±6.47 53.67±7.99 925.87±142.26 551.57±105.37a316.89±31.00ab138.14±13.86abc0 40 66 85

2.2 HE染色觀察裸鼠移植瘤移植瘤大體上呈結節性、膨脹性生長，質硬，外有薄膜包裹。HE染色觀察裸鼠移植瘤(×200)示：對照組(圖1)：可見大量癌細胞分布，且癌細胞生長旺盛，形態不規則，呈高度異型性，其核大深染，核質比例增大，核分裂相多見，鏡下腫瘤組織實質多于間質；大蒜素組(圖2)：可見腫瘤細胞減少；5-FU組(圖3)：可見瘤組織大量壞死，癌細胞數減少，細胞核腫大，部分核固縮；大蒜素聯合5-FU組(圖4)：可見大量腫瘤組織呈現片狀壞死，癌細胞增大且出現空泡變性，癌細胞數明顯減少，纖維組織增生。

圖1 對照組（×200）：腫瘤組織實質多于間質，癌細胞分布密集，且生長旺盛，呈高度異型性；圖2大蒜素組（×200）：腫瘤細胞分布稀疏，可見部分壞死區域;圖35-FU組（×200）：腫瘤組織大量壞死，細胞核腫大，部分核固縮；圖4大蒜素聯合5-FU組（×200）：可見大量腫瘤組織呈現片狀壞死。癌細胞數明顯減少，且出現空泡變性。

3 討論

腺樣囊性癌曾被稱為“圓柱瘤”，是一種易發于口腔頜面部唾液腺組織中的惡性腫瘤，其在各個年齡階段均有發生，目前人涎腺腺樣囊性癌的治療常規以手術治療結合術前術后放化療為主。5-FU是治療ACC的常用化療藥物，但療效往往不佳，主要系因其對放療和化療的敏感性均較低，療效不顯著，且手術切除后易復發、易沿神經擴散以及易發生遠處轉移等特點，致使腺樣囊性癌患者出現較高的死亡率[1]。有關腺樣囊性癌的發病和轉移機制尚未完全闡明，加上其對于藥物的敏感性較低，耐藥性較強，因此利用動物模型研究其有效的防治方法顯得尤為重要。侯亞麗等[9]將人復發性涎腺腺樣囊性癌組織塊進行裸鼠皮下移植，連續傳代4次，成功構建了腺樣囊性癌裸鼠移植瘤模型，其結果表明與原代瘤相比，傳代瘤的潛伏期和體積倍增時間均較短。本研究將人腺樣囊性癌ACC-M細胞接種于裸鼠右前斜背部皮下，成功構建了裸鼠皮下移植瘤模型，為進一步研究其藥物防治提供基礎。

大量研究表明大蒜在防癌抗癌中均具有良好的作用，而大蒜素由大蒜提取而來，其含有多種含硫化合物，具有較強的殺菌作用，在防癌抗癌中也發揮重要作用[3-6]。王海燕等[10]研究發現大蒜素對兩種胃癌SGC-7901和MGC-803細胞均具有較強的殺傷作用，其可能通過直接殺傷胃癌細胞從而提高機體免疫來發揮抗癌作用。徐麗等[11]研究發現大蒜素可促進體外培養的NK細胞的增殖作用，抑制NK細胞的凋亡，并通過促進NK細胞分泌IFN-γ提高其對腫瘤的殺傷能力。馬紅兵等[12]研究發現大蒜素可抑制胰腺癌BXPC3細胞的生長，且具有放射增敏的作用。5-FU是一種廣泛應用于頭、頸、胸、胃腸和卵巢等部位惡性腫瘤的化療藥物，其作用機制為5-FU在細胞內轉化產生的活性產物能影響DNA和蛋白質的合成，從而抑制腫瘤細胞的生長[13]。但5-FU的不良反應、對腺樣囊性癌較低的敏感性以及腺樣囊性癌對5-FU產生的耐藥性等導致其療效欠佳，因此5-FU與其他藥物進行聯合用藥是目前研究的熱點。研究表明黃癸素和5-FU聯用對腺樣囊性癌Acc-3細胞的抑制作用比單藥使用更明顯[14]。Zou等[15]研究發現大蒜素可通過ROS介導的線粒體途徑增強肝癌細胞對5-FU的敏感性。王曉峰等[2]研究發現萊菔硫烷和5-FU聯合使用可協同抑制人高轉移唾液腺腺樣囊性癌細胞的增殖，且可能與細胞核NF-kB p65的表達受抑制有關。吳發印等[7-8]研究發現大蒜素聯合5-FU以及大蒜油聯合5-FU均可有效抑制ACC-M細胞的生長，且其作用明顯強于大蒜素、大蒜油或5-FU單獨使用。之前的研究是在細胞水平上探討大蒜素聯合5-FU的作用效果，本研究通過建立ACC-M細胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型，探討大蒜素聯合5-FU在動物水平上對腺樣囊性癌的抑制作用。結果表明大蒜素、5-FU單獨使用以及大蒜素聯合5-FU對裸鼠體內ACC-M細胞移植瘤的生長均有明顯的抑制作用，大蒜素的抑瘤率為40%，5-FU為66%，而大蒜素聯合5-FU組高達85%，即大蒜素聯合5-FU使用的抑制作用明顯強于大蒜素或5-FU單獨使用，可能是因為大蒜素增強了5-FU的藥效的同時減輕了其副作用，與5-FU聯合使用時對腺樣囊性癌有協同抑制作用。本研究進一步證實了大蒜素和5-FU的抗癌作用，為拓展其臨床應用奠定基礎。

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Inhibitory effects of allicin combined with 5-FU on adenoid cystic carcinoma ACC-M in nude mice model.

CHE Chao1,WU Fa-yin1,LI Hua-lin1,ZHOU He-feng2.1.Department of Stomatology,Zhuhai Hospital,the Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zhuhai 519100,Guangdong,CHINA;2.Department of Bioengineering,Zhuhai Campus,Zunyi Medical University,Zhuhai 519041,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of allicin combined with 5-fluorouracil(5-FU)on adenoid cystic carcinoma in nude mice models transplanted with ACC-M cells.MethodsThe nude mice xenograft models were established by subcutaneous injecting human adenoid cystic carcinoma cell line ACC-M into Balb/c nude mice.Twenty-four xenograft model rats were randomly divided into four groups(control group and three experimental groups of allicin group,5-FU group,and allicin combined with 5-FU group),with 6 rats in each group.The rates in the four groups received intraperitoneal injection of 0.01 mL/g medicine according to the weight of each nude mice,0.9% phosphate buffer saline(PBS),20 μg/mL allicin,20 μg/mL 5-FU,and 20 μg/mL allicin combined with 20 μg/mL 5-FU respectively,once per two days,for three times.The animals were executed after 1 week for measuring the xenograft tumor volume and observing the pathological changing by HE staining.ResultsThe xenograft tumor volume of three experimental groups had narrowed considerably.The tumor volume was significantly decreased in the 5-FU group compared with Allicin group,with statistically significant difference between allicin combined with 5-FU group and allicin group,5-FU group(P＜0.01).Under microscope,the cancer cells of the control group showed vigorous growth and high abnormal rate,while the cancer cells of the three experimental groups showed reduced quantity and increased intercellular substance to different extent,especially in allicin combined with 5-FU group.ConclusionAllicin and 5-FU can both effectively inhibit the growth of nude mice xenograft tumor of adenoid cystic carcinoma.And the inhibitory effects of allicin combined with 5-FU is more significant than either allicin or 5-FU used alone.

Allicin;5-fluorouracil;Adenoid cystic carcinoma(ACC);Nude mice;Xenograft tumor

R-332

A

1003—6350（2016）21—3441—03

2016-07-08)

貴州省科學技術基金項目[編號：黔科合J字LKZ(2010)07號]

吳發印。E-mail：wufy0515@163.com