應用核型分析法鑒定家畜胚胎性別

王士勇

（黑龍江省巴彥縣畜牧獸醫局，黑龍江巴彥 151800）

應用核型分析法鑒定家畜胚胎性別

王士勇

（黑龍江省巴彥縣畜牧獸醫局，黑龍江巴彥 151800）

核型分析是根據動物染色體著絲點位置、臂比、染色體長度、隨體的有無等特征，并借助染色體分帶技術對某一生物的染色體進行比較、分析、排序和編號。其分析以體細胞分裂中期染色體為研究對象。染色體組型分析是細胞遺傳學研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結構、形態與功能之間關系所不可缺少的重要手段。

家畜；胚胎；核型分析法；鑒定

1 鑒別原理

不同物種的染色體都有各自特定的形態結構，包括染色體的長度、著絲點位置、臂比、隨體大小等特征，而且這種形態特征是相對穩定的。經行核型分析后，可以根據染色體結構和數目的變異來判斷生物的病因，比如是由于缺少了什么樣的基因才導致的這種疾病。以動物胚胎性別鑒定為目的的核型分析常一般采用切割胚（晚期桑葚胚、囊胚或擴張囊胚），一半用于鑒定性別，另一半用于移植或冷凍。如果目的是為了擴張囊胚，切割時可切成含內細胞團的半胚和含滋養層細胞的半胚，前者用于冷凍、移植，后者用于核型分析。

2 分割胚胎

在牛，以非手術法采集7日齡胚胎，選擇活力強、發育正常的胚胎以備切割。用2%鏈霉蛋白酶處理1分鐘以脆化透明帶，在顯微操作儀下切割胚胎。其中一半裝人透明帶，在37℃、5%二氧化碳條件下培養以備移植，或用牛的血清瓊脂包埋以便冷凍。另一半亦裝入透明帶，用于核型分析。

3 半胚預培養及有絲分裂阻滯

擬作核型分析的半胚在含20%滅活FCS的M199培養液中培養15h（用培養皿或96孔板培養）。預培養時間與半胚性別鑒定率顯著相關。預培養2h、6h和15h，對半胚的性別鑒定率分別為25%、81%和95%。

預培養結束后，加入有絲分裂阻斷劑繼續培養，使有絲分裂停止在分裂中期。常用的分裂阻斷劑有秋水仙素、去甲秋水仙素、長春花堿或硫酸長春花堿與鬼臼毒素（V-P）。分裂阻斷劑的濃度和處理時間對分裂相的產生和染色體分散程度關系極大。如果濃度不夠或處理時間過短，則標本中分裂相少；如濃度過高或處理時間過長，雖然標本中分裂相多，但其染色體收縮得太短，難于計數和分析。各種阻斷劑有其獨自的最適濃度和處理時間。因此，在預實驗中應根據實驗室條件和所用培養液，對分裂阻斷劑的濃度和作用時間進行比較，以便獲得既有足夠的分裂中期相，又有長度適合的染色體。

在對牛體外受精的2細胞胚進行核形分析時發現，V-P優于去甲秋水仙素。當在M199中加入0.08μg/mlV-P或0.04μg/ml去甲水仙素阻斷分裂時，核型分析率分別為69.1%和42.9%。他進一步比較了用0.08μg/mlV-P處理胚胎的時間對核型分析率的影響，在處理4h、8h和12h以后，核型分析率分別為50.0%、81.5%和100%。據此認為，以0.08μg/mlV-P處理12h為更為合適。然而，有關科研人員在對切割后的早期桑葚胚和囊胚進行性別鑒定時發現，去甲秋水仙素優于長春花堿，其半胚性別鑒定率分別為87%和46%。其處理條件是在培養液中含0.04μg/ml去甲秋水仙素，處理4h?？蒲腥藛T用小鼠擴張囊胚比較了秋水仙素在不同培養液中的作用。將秋水仙素以0.4μg/ml的濃度，分別溶解于BMOC-3、MEM+20%FCS和PBS+20%FCS中分裂阻滯處理2h，其每枚胚胎中期分裂相分別為2.2～10.6、0.3～7.3和-0.1～6.9，故認為BMOC-3是秋水仙素理想的培養液。他還比較了不同秋水仙素濃度、不同作用時間對核型分析的影響，發現隨培養時間的增加，中期分裂相增加，但由于細胞退化而使細胞核反而減少。故建議小鼠胚胎以每1mlBMOC-3中含0.4μg秋水仙素、培養2h為宜。但將此法用于牛胚胎核型分析時，中期分裂相獲得率為81.0%（34/32），性別鑒定率僅為38.2%（13/42）。看來不同的動物也許有各自的最佳條件。

4 染色體標本制作

將經分裂阻斷劑處理后的半胚移入0.88%或0.9%的檸檬酸鈉溶液中處理7min，使細胞膨脹、染色體分開，然后將該半胚移到干凈無油脂載玻片的一個低滲小滴中，再加第一固定液（甲醇：醋酸：無離子水＝3：2：1）固定處理1min，最后將第二固定液（醋酸）直接加到半胚上，溶解透明帶，使胚細胞分散，37℃風干1min。

5 染色及鏡檢

風干后的標本以pH 7.0左右的PBS配制的10%吉姆薩染色液染色，晾干后直接用中性樹膠封固成永久性標本。也可將玻片標本先經二甲苯透明后再封固。染色體標本在100倍顯微鏡下檢查。各種家畜的染色體數目（常染色體加性染色體）有所不同，性染色體的形態亦各有特點。牛、馬、綿羊、山羊和豬的染色體總數分別為60、64、54、60和38，其中均含有一對性染色體（XX或XY）。一般X染色體較大，Y染色體很小。各種家畜性染色體的特征描述如下。

對于家牛，X染色體特征：大，亞中部著絲粒大；Y染色體特征：小，中部著絲粒。對于瘤牛，X染色體特征：大，亞中部著絲粒；Y染色體特征：小，亞端部著絲粒。對于山羊，X染色體特征：大，亞端部著絲粒（具有微小短臂）；Y染色體特征：微小，中部著絲粒。對于豬，X染色體特征：中等大小，中部著絲粒；Y染色體特征：小，中部著絲粒。對于綿羊，X染色體特征：大，亞端部著絲粒；Y染色體特征：微小，中部著絲粒。對于馬，中等大小，亞中部著絲粒；Y染色體特征：小，亞端部著絲粒。

核型分析是一項很細致的研究工作，在進行性別判定時，應嚴格依據各種家畜性染色體的特征認真觀察比較各種動物（特別是家畜肋動物，如牛、綿羊、豬、家兔等）的染色體特征，可供胚胎性別鑒定時參考。

[1]田萬強，魏紅芳，昝林森.家畜早期胚胎性別鑒定方法在畜牧業中的應用[J].黃牛雜志，2001，27（5）：43-46.

王士勇（1971—），男，黑龍江巴彥縣人，本科，高級畜牧師，主要從事畜牧工作。