小鼠流感病毒性肺炎模型中腸道的病變及在中醫理論研究中的應用

張淑靜 吳 瑩 齊曉宇 葛東宇 李根茂 玄子男 王 謙 王旭丹 李姝玉

（北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029）

?

小鼠流感病毒性肺炎模型中腸道的病變及在中醫理論研究中的應用

張淑靜 吳 瑩 齊曉宇 葛東宇 李根茂 玄子男 王 謙 王旭丹 李姝玉

（北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029）

摘要目的：建立小鼠流感性肺炎模型，明確呼吸道流感病毒感染過程中是否存在特異性的腸道病理損傷，并探討了其在“肺與大腸相表里”研究中的應用。方法：BALB／c小鼠48只隨機分為正常組、病毒組。病毒組給予50 μL、50LD50病毒液滴鼻建立流感病毒感染的小鼠肺炎模型，感染后第3、5、6天分別取材，HE染色檢測肺臟、大腸、小腸、心臟、肝臟、腎臟組織病理結果，血生化檢測血清谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）和尿素氮（BUN）水平。結果：流感病毒感染后，病毒組小鼠肺組織出現明顯的炎性病變外，隨時間延長肺組織充血水腫出血加重；小腸黏膜腺體排列紊亂，絨毛粗大、部分脫落，黏膜固有層炎性細胞浸潤；大腸黏膜固有層、肌層大量炎性細胞浸潤，腺體結構消失、脫落；而心臟、肝臟、腎臟無明顯病理改變；病毒組小鼠血清AST、ALT、BUN較正常組相比，差異無統計學意義。結論：小鼠流感病毒性肺炎模型中存在小腸、大腸特異性免疫病理損傷，是研究中醫“肺與大腸相表里”理論及相關臨床治法的理想模型。

關鍵詞流感病毒；肺炎；腸道免疫病理；肺與大腸相表里

Pathologlcal Damage of Intestlne ln the Vlral Pneumonla Mouse Model and lts Appllcatlon ln the Theoretlcal Research of Tradltlonal Chlnese Medlclne

Zhang Shujing，Wu Ying，Qi Xiaoyu，Ge Dongyu，Li Genmao，Xuan Zinan，Wang Qian，Wang Xudan，Li Shuyu （Basic Medical Science College of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objectlve：To establish viral pneumonia mouse models infected by influenza virus，and observe whether there is a specific intestinal pathological damage in the process of respiratory influenza virus infection，then discuss its application on the research of the theory“the lung and the large intestine being interior-exteriorly related”in Traditional Chinese Medicine. Methods：A total of 48 BALB／c mice were randomly divided into the normal group and the virus group. Influenza virus 50 μL 50 LD50and mouse lung-adapted strain，was intranasally inoculated to the virus group. On the 3，5 and 6 day of infection，HE staining was used to detect the pathologic changes／in lungs，large intestines，small intestines，hearts，livers and kidneys. In addition，blood biochemistry was used to detect the levels of aspertate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT），urea nitrogen （BUN）in serum. Results：After infection，the lungs of the mice in the virus group showed obvious inflammatory pathological changes，and hyperemia edema，hemorrhage in the lung tissues aggravated with time；the arrangement of mucosal glands in the small intestines was disordered with the villus swelling and partial detachment，and the mucosa lamina propria was infiltrated with lots of inflammatory cells；the large intestine lamina propria and the muscular layer has been infiltrated with large number of inflammatory cells and the muscle layer glandular structures disappeared. However，the heart，liver and kidney had no obvious pathological changes，and the AST，ALT，BUN levels in the virus group showed no significant difference. Concluslon：The viral pneumonia mouse model infected with influenza virus exists specific immunologically pathological damage in the small intestine and the large intestine. It serves as an ideal model to study the Traditional Chinese Medicine theory“the Lung and the Large Intestine being interior-exteriorly related”and the related clinic treatment.

Key Words Influenza virus；Viral pneumonia mouse model；Intestinal munological pathology；the lung and the large intestine being interior-exteriorly related

流感是由流感病毒感染引起的急性呼吸道傳染病。臨床上，流感最常見的癥狀包括發熱、咳嗽、頭痛、乏力，并常伴有胃腸炎樣癥狀，如腹瀉、上腹疼痛、惡心、嘔吐［1-4］。2014年，Wang等在小鼠流感病毒性肺炎模型中發現：呼吸道流感病毒感染會引起小腸免疫損傷，對肝臟和腎臟卻沒有影響；并揭示了流感病毒感染誘發胃腸炎的機制，流感病毒感染誘導的小腸免疫損傷并非流感病毒的直接感染導致的，而是由肺源性CCR9＋，CD4＋T細胞向腸道組織遷移，引起腸道菌群失調所致［5］。然而，Wang等的研究中小鼠的腸道病變主要在小腸，對于大腸僅描述了感染小鼠結腸長度較正常小鼠明顯縮短［5］。既然腸道菌群失調是呼吸道流感病毒感染后誘發腸道炎性損傷的關鍵，而腸道菌群主要寄生在大腸，那么，呼吸道流感病毒感染是否會引起大腸的炎性病變，需要進一步明確。

“肺與大腸相表里”是中醫臟腑理論體系中的重要內容，其源于《黃帝內經》，《靈樞·本輸》篇曰“肺合大腸，大腸者，傳導之府”。目前常用的研究“肺與大腸相表里”的實驗動物模型為以便秘為主要腸道表現的哮喘小鼠或潰瘍性結腸炎小鼠模型［6-9］，然而，這些模型的肺腸病變是否具有特異性，仍不清楚，并無相關報道。因此，本研究通過觀察小鼠流感病毒性肺炎模型中肺臟、小腸、大腸、心臟、肝臟、腎臟的病變情況，進一步驗證該模型中腸道的病變是否具有特異性，為該模型在肺與大腸相表里理論及相關臨床治法研究中的應用奠定基礎。

1　資料與方法

1. 1 一般資料

1. 1. 1 動物與病毒株 雄性BALB／c小鼠48只，體重16～18 g，購自北京維通利華實驗動物中心，動物合格證號SCXK（京）2007-0001；病毒株：流感病毒甲型鼠肺適應株A／FM／1／47（H1N1），由中國預防醫學科學院病毒學研究所提供，常規雞胚復蘇傳代，SPF種蛋購自北京維通利華實驗動物中心。

1. 1. 2 藥物與試劑 HE染色試劑盒購自北京益利精細化學品有限公司，乙醇、二甲苯購自北京化工廠（分析純），石蠟（54～56℃）購自國藥集團化學試劑有限公司，Na2HPO4、KH2PO4和NaCl（1XPBS溶液），甲醛等購自國藥集團化學試劑有限公司，鼠血清ALT、AST和BUN水平檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（貨號分別為C009-2、C0010-2和C013-2）。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 分組與造模 將BALB／c小鼠隨機分為正常組、病毒組，每組24只，腹腔注射50 μg／g體重的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，約10～15 min，待小鼠深度麻醉后，抓取小鼠使其鼻孔朝上，并對病毒組小鼠以50 μL、50LD50病毒液滴鼻感染，正常組小鼠用等量無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）滴鼻對照。滴鼻感染結束后，讓小鼠側臥至自然蘇醒。

1. 2. 2 流感病毒的擴增 將購買來的SPF種蛋氣室朝上，室溫靜置至少24 h，在37. 9℃，濕度40%～60%，通風的孵化箱中孵化，每隔3～4 h保持氣室向上水平翻轉一次，使其均勻受熱孵化，每天檢查雞胚的生長情況，及時發現并剔除死胚。使用前將病毒接種于9日齡雞胚，尿囊腔傳代，常規培養，48h收集新鮮無菌尿囊液，傳代兩次。做微量血凝試驗（HA）測病毒血凝效價，血凝滴度為1∶512，體內感染小鼠，采用Reed Muench法［10］測定計算其對小鼠的半數致死量（LD50）為10－3. 877。

1. 2. 3 小鼠一般情況觀察、體重檢測 將隨機分配的正常組、病毒組小鼠，作標記，連續6 d記錄小鼠的體重，并記錄小鼠的一般情況觀察進行打分，打分的具體方法為：0分，健康；1分，幾乎不翹毛；2分，翹毛，但仍然活潑；3分，翹毛并且不活潑；4分，翹毛或不活潑；5分，死亡。

1. 2. 4 HE染色進行組織病理學分析 正常組和病毒組小鼠于感染后3 d、5 d、6 d，小心快速摘取肺臟、大腸、小腸、肝臟、心臟、腎臟等組織于10%的福爾馬林中固定，流水中沖水過夜，梯度酒精中脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，將組織切片厚為5～7 μm，HE染色后脫水透明，中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察結果并拍照。

1. 2. 5 生化檢測 正常組和病毒組小鼠于感染后3 d、5 d、6 d，摘眼球取血，室溫靜止30 min，3 000 r／min離心，收集血清，于－80℃冰箱保存。鼠血清中谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）和血清尿素氮（BUN）水平檢測按南京建成試劑盒說明書檢測。通過檢測血清AST、ALT、和BUN的水平來反映小鼠心臟、肝臟、腎臟的功能。

1. 3 統計學方法 各分組所得計量數據采用均數±標準差（±s）表示，用SPSS 16. 0軟件處理數據，2組間均數比較用t檢驗。檢驗水準α＝0. 05，P＜0. 05有統計學意義

2　結果

2. 1 小鼠流感病毒感染后一般情況及體重的觀察正常組小鼠健康，精神良好，行為敏捷，皮毛順滑光亮，呼吸正常；病毒組小鼠在感染后第2 d出現食欲明顯下降，呼吸加快、短促，以腹式呼吸為主，行動遲緩無力、毛發雜亂、翹毛、體溫下降，第3～4天病情加重，喘促明顯，蜷縮、怕冷、寒顫、皮毛無光澤，第6天開始出現死亡（圖1）。正常組小鼠體重無明顯變化，病毒組小鼠體重逐漸下降（圖2）。

圖1　小鼠流感病毒滴鼻感染后一般情況的觀察

圖2　小鼠流感病毒滴鼻感染后體重的變化

圖3　小鼠流感病毒感染后肺臟的病理變化（HE染色10×20）

圖4　小鼠流感病毒感染后小腸的病理變化（HE染色10×20）

2. 2 小鼠流感病毒感染后肺臟、小腸、大腸的病理變化 正常組小鼠肺泡大小較一致，肺泡壁菲薄，支氣管上皮完整，管腔內無分泌物。感染第3天，病毒組小鼠肺組織出現小支氣管炎，中性粒細胞浸潤。第5天病灶范圍進一步擴大，肺泡壁大量炎性細胞浸潤，肺泡壁增寬，結構不清，出現水腫。第6天肺組織病變進一步加重，幾乎累及全肺，肺泡腔中炎性滲出明顯，出血水腫進一步加重，大量上皮脫落，肺泡壁結構不清（圖3）。病毒組小腸黏膜腺體排列紊亂，絨毛粗大、部分脫落，黏膜固有層淋巴細胞大量浸潤（圖4）；大腸黏膜固有層、肌層大量淋巴細胞浸潤，腺體結構消失、脫落（圖5）。

圖5　小鼠流感病毒感染后大腸的病理變化（HE染色10×20）

2. 3 小鼠流感病毒感染后心臟、肝臟和腎臟組織病變的觀察 HE染色結果顯示，與正常組相比，病毒組小鼠心臟、肝臟和腎臟組織正常，無明顯病理改變（圖6、圖7、圖8）。

2. 4 小鼠流感病毒感染后心臟、肝臟和腎臟組織功能檢測 病毒組小鼠血清AST、血清ALT和血清BUN檢測結果與正常組相比，差異無統計學意義（P ＞0. 05），說明流感病毒感染小鼠心臟、肝臟和腎臟功能無明顯異常（圖9、圖10、圖11）。

圖6　小鼠流感病毒感染后心臟的病理變化（HE染色10×20）

圖7　小鼠流感病毒感染后肝臟的病理變化（HE染色10×20）

圖8　小鼠流感病毒感染后腎臟的病理變化（HE染色10×20）

3　討論

腹瀉、惡心是流感最常見的呼吸道外臨床表現。2014年，Wang等在J Exp Med雜志上首次報道了呼吸道流感病毒感染引起腸道免疫損傷的現象及機制，從而引起學術界廣泛的關注與興趣。利用流感性肺炎小鼠模型，Wang等發現，流感病毒感染后，肺源性CCR9＋CD4＋T淋巴細胞在趨化因子CCL25作用下特異性地向腸道組織遷移。進入腸道的CCR9＋CD4＋T細胞產生IFN-γ，改變了腸道微生物的組成（腸道菌群失調）。腸道微生物的改變明顯刺激了腸道上皮細胞中IL-15的產生，促使了Th17細胞在小腸原位的極化，導致了腸道的免疫病理損傷。Wang等的研究解釋了臨床上流感感染后，除了呼吸道癥狀外，出現最常見的腸外癥狀——胃腸炎樣癥狀（尤其是在兒童中），如上腹疼痛，惡心、嘔吐，腹瀉等的機制。Wang等提出，腸道菌群構成的變化（菌群失調）介導了呼吸道流感病毒感染誘導的特異性腸道免疫損傷。劉駿等的實驗也證實了流感病毒感染后存在腸道菌群的數量及組成的變化［11］。目前，盡管不同實驗室報道流感病毒感染后腸道菌群的構成及數量變化不完全一致，但流感病毒肺部感染造成腸道菌群失調，是被研究者公認的。

圖9　小鼠流感病毒滴鼻感染后血清AST指標檢測

圖10　小鼠流感病毒滴鼻感染后血清ALT指標檢測

圖11　小鼠流感病毒滴鼻感染后血清BUN指標檢測

然而，Wang等報道的流感病毒性肺炎小鼠的腸道損傷主要表現在小腸的炎性病變，對于腸道菌群主要寄生的大腸的病變，并沒有詳細的報道，僅觀察到感染小鼠結腸長度的縮短。基于腸道菌群失調是流感誘發腸道損傷的關鍵環節，而腸道菌群主要寄生在大腸中，我們在本研究中觀察了流感病毒感染小鼠模型中肺臟、小腸、大腸、心臟、腎臟、肝臟病變情況，以明確流感病毒感染后是否存在大腸的病變，并進一步驗證了腸道病變的特異性。研究結果表明，小鼠流感病毒感染后，除了肺部明顯的炎性病變外，小腸、大腸均有病變，表現為黏膜腺體排列紊亂，絨毛脫落，固有層炎性細胞浸潤，并伴有腹瀉的表現。通過進一步檢測了其他臟器的情況，證實了心臟、腎臟、肝臟均無病變，說明流感病毒感染肺部所誘導的腸道免疫損傷具有特異性。我們的研究進一步證實小鼠流感病毒性肺炎模型中存在特異性腸道病變，病變累及小腸及大腸組織。

“肺與大腸相表里”是近年來中醫臟腑理論研究的熱點。張景岳《類經·十二經病》中云：“大腸與肺為表里，肺主氣，而津液由于氣化，故凡大腸之或瀉或秘，皆津液所生之病，而主在大腸也”。中醫所講的大腸與西醫有所不同，相當于西醫解剖學中的回腸與結腸上段［12］。肺與大腸不僅在生理上相互聯系，而且在病理上相互影響，出現肺病及腸或腸病及肺，肺腸之病可以相互傳變，甚至持續形成惡性循環［13］。有研究發現，在小鼠氣道性哮喘模型中，腹腔注射大黃素具有抵抗肺部炎性反應的作用［14］，經芒硝刺激大腸后，芒硝組小鼠血清中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞總數均明顯減少，血清IgE含量明顯降低，芒硝“從腸論治”可以有效抑制哮喘小鼠氣道炎性反應，改善氣道免疫微環境。人感染流感病毒后，不論是輕癥還是重癥，常伴有腹瀉、腹痛的癥狀；小鼠流感病毒性肺炎模型中，所有感染鼠均有明顯腹瀉，并持續整個感染過程。因此，人的流感感染與小鼠流感病毒性肺炎均具有“肺病及腸”的表現，并且具有特異性，不累及其他臟器。

有趣的是，耶魯大學Akiko Iwasaki實驗組報道，肺臟抗流感病毒的免疫應答也受到腸道菌群的調節。Takeshi Ichinohe等的研究表明，呼吸道流感病毒感染機體時，腸道菌群的組成對調節病毒特異性CD4＋和CD8＋T細胞的產生及抗體反應起關鍵作用，腸道菌群可通過激活適當的炎性因子，在呼吸道黏膜的調節性免疫中發揮作用；腸道菌群失調的小鼠肺臟抗流感病毒的免疫應答障礙，使肺組織中流感病毒無法清除，小鼠死亡率增加［15］。因此，正常的腸道菌群在維持肺臟抗病毒免疫中具有至關重要的作用，腸道菌群失調小鼠肺臟抗病毒免疫功能受損。由此可見，流感病毒性肺炎小鼠中存在肺腸病變的循環，是研究“肺與大腸相表里”理論及臨床治法的理想模型。然而，目前此模型在中醫臟腑理論研究中較少運用，我們的研究為此模型在相關研究中的運用以及探討中藥調節腸道菌群防治流感的機制奠定了基礎。

參考文獻

［1］Baden LR，Drazen JM，Kritek PA，et al. H1N1 influenza A disease——information for health professionals［J］. N Engl J Med，2009， 360（25）：2666-2667.

［2］Chan MC，Lee N，Chan PK，et al. Fecal detection of influenza A virus in patients with concurrent respiratory and gastrointestinal symptoms ［J］. J Clin Virol，2009，45（3）：208-211.

［3］Shinde V，Bridges CB，Uyeki TM，et al. Aassortant swine influenza A （Hl）in humans in the United States，2005-2009［J］. N Engl J Med，2009，360（25）：2616-2625.

［4］Chenyue Zhang，Ying Wu，Zinan Xuan，et al. p38MAPK，Rho／ROCK and PKC pathways are involved ininfluenza-induced cytoskeletal rearrangement and hyperpermeabilityin PMVEC via phosphorylating ERM ［J］. Virus Research，2014，192（11）：6-15.

［5］Wang J，Li F，Wei H，et al. Respiratory influenza virus infection induces intestinal immune injury via microbiota-mediated Th17 cell-dependent inflammation［J］. J Exp Med，2014，211（12）：2397-2410.

［6］鄭秀麗，楊宇，王寶家，等.從病理狀態下肺功能與胃腸功能的變化探討“肺與大腸相表里”［J］.中華中醫藥雜志，2014，29（1）：120-123.

［7］鄭秀麗，楊宇，王寶家，等.過敏性哮喘大鼠模型結腸和肺組織CCK-8、CGRP、SP及VIP變化觀察［J］.中國中西醫結合雜志，2013，33（12）：1668-1671.

［8］閆昕，王新月，盛益華，等.從潰瘍性結腸炎大鼠肺組織炎性細胞因子及氧自由基表達的變化看肺與大腸相表里［J］.中國中西醫結合雜志，2014，34（4）：455-459.

［9］高譽珊，劉妙，張淑靜，等.動物模型在經方研究中的應用［J］.世界中醫藥，2015，10（1）：13-16.

［10］郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其實驗技術［M］.北京：中國三峽出版社，1997：111-112.

［11］劉駿，王輝，孫經夢，等.流感病毒感染對小鼠腸道菌群的影響及桑葉的調節作用［J］.中國微生態學雜志，2013，25（9）：1001-1009.

［12］董麗，張茂平，王俊峰.“肺與大小腸相表里”的探討［J］.中國醫藥指南，2008，6（24）：219-222.

［13］陳麗斌，紀立金，高思華.基于“同氣相求”理論探索肺與大腸的表里構建［J］.中華中醫藥雜志，2013，28（12）：3483-3486.

［14］Wang Tan，Zhong Xianggen，Li Yuhang，et al. Protective effect of emodin against airway inflammation in the ovalbumin induced mouse model［J］. Chin J Integr Med，2015，21（6）：431-437.

［15］Ichinohe T，Pang IK，Kumamoto Y，et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（13）：5354-5369.

（2015－08－20收稿 責任編輯：王明）

中圖分類號：R228

文獻標識碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 028

通信作者：吳瑩（1980. 01—），女，博士，副教授，研究方向：中醫藥防治病毒性疾病的作用及機制，E-mail：aqiwuying＠hotmail. com

作者簡介：張淑靜（1984. 09—），女，碩士，實驗師，研究方向：中西醫結合基礎，E-mail：jingshuzhang＠126. com

基金項目：國家自然科學基金面上項目（編號：81473520）