布渣葉超高效液相指紋圖譜研究

陳偉韜梁之桃周立敏周勁松趙中振

（1廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東廣州，510095；2香港浸會大學，香港；3廣州中醫藥大學，廣東廣州，510405）

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布渣葉超高效液相指紋圖譜研究

陳偉韜1，2梁之桃2周立敏2周勁松3趙中振2

（1廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東廣州，510095；2香港浸會大學，香港；3廣州中醫藥大學，廣東廣州，510405）

摘要目的：建立布渣葉超高效液相指紋圖譜，為快速有效對布渣葉進行質量評價，改進其質量控制方法提供理論依據。方法：采用Waters Acquity BEH UPLC C18色譜柱（2. 1 mm×100 mm，1. 7 μm），以乙腈-0. 1%甲酸水溶液作為流動相梯度洗脫，檢測波長為278 nm，流速為0. 3 mL／min，柱溫為20℃；對建立的布渣葉指紋譜圖進行相似度計算，并對數據進行主成分分析。結果：方法學考察結果良好，確立了11個共有峰，布渣葉指紋圖譜的相似度明顯高于偽品；主成分分析結果顯示布渣葉密集分布在一個區域內，偽品分布在該區域外。結論：該方法穩定可靠，能對布渣葉藥材作出真偽優劣評價，為建立布渣葉超高效液相指紋圖譜提供理論依據。

關鍵詞布渣葉；指紋圖譜；超高效液相色譜。

Study on Chemlcal Flngerprlnt of Mlcroctls Follum by Ultra Performance Llquld Chromatography

Chen Weitao1，2，Liang Zhitao2，Zhou Limin2，Zhou Jinsong3，Zhao Zhongzhen2
（1 Guangdong Province Engineering Technology Research Institude of T. C. M.，Guangzhou China；2 Hong Kong Baptist University，Hong Kong China；3 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou China）

Abstract Objectlve：To establish the chemical fingerprint of Microctis Folium by ultra performance liquid chromatography（UPLC）. Methods：The separation was developed on ACQUITY UPLC BEH C18column（2. 1 mm×100 mm，1. 7 μm）by gradient elution with acetonitrile-water containing 0. 1%formic acid as mobile phase at a flow rate of 0. 3 mL／min，the detection wavelength at 278 nm and column temperature at 20℃. The fingerprint was evaluated by similarity assay and principal component analysis （PCA）. Results：Eleven characteristic peaks were established in the fingerprint，and two peaks were identified. The similarities of Microctis Folium was calculated and used for differentiating its adulterant. PCA showed that Microctis Folium and its adulterant were distinctly separated by the three most important principal components. Concluslon：The method is stable and reliable which could be applied to the authentication and quality control of Microctis folium.

Key Words Microctis Folium；Fingerprint；UPLC

布渣葉（Microctis Folium）來源于椴樹科（Tiliaceae）植物破布葉（Microcos paniculata L.）的干燥葉。性涼、味微酸，歸脾、胃經。有消食化滯，清熱利濕的功效，可用于治療飲食積滯，感冒發熱，濕熱黃疸［1-2］。布渣葉分布于廣東、海南、廣西、云南等地［3］。其中以廣東分布資源最為豐富，廣東的陽西、湛江是主產地。生于叢林中、灌叢中或路旁。本品無毒，民間有將其采葉曬干泡茶飲的習慣，亦是涼茶配方的常見材料，有清熱、解渴、開胃的作用。

目前2010版中國藥典對評價布渣葉質量的含量檢測成分僅牡荊苷一項，牡荊苷具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、降糖等與布渣葉功效相關的藥理作用［4-6］，但并無直接證據可表明牡荊苷為布渣葉的有效成分［7］，且以單一成分的檢測來評價中藥過于片面［8］，因此建立布渣葉指紋圖譜具有科學意義。本研究采用UPLC建立布渣葉指紋圖譜，與現時布渣葉指紋圖譜的研究相比較，具有分析時間更短，分析能力更強的優點［9-10］。研究通過相似度計算、主成分分析等方法對指紋圖譜進行評價，為布渣葉質量評價研究提供一種快速、高效的新方法。

1　資料與方法

1. 1 儀器 ACQUITY UPLC（Waters，配有二極管數組檢測器，Empower2色譜工作站）；MILLIPORE純水機（美國）；冷凍干燥機（TriadTM）；分析天平（AdventurerTM）；離心機（Eppendorf Centrifuge 5810）；高速離心機Eppendorf Centrifuge 5417R，超聲儀（CREST）。

1. 2 試劑 甲醇為分析純（RCI Labscan Limited）；液相色譜用的甲醇、乙腈、甲酸為色譜純（RCI Labscan Limited）；水為超純水。

1. 3 藥品 布渣葉藥材經廣州醫藥大學周勁松博士鑒定為椴樹科植物破布葉（Microcos paniculata L.）的干燥葉，樣品來源見表1，其中18至21號為新鮮采摘后冷凍干燥品，10號樣本為偽品。牡荊苷（上海同田生物技術有限公司，13082932）；異牡荊苷（成都瑞芬思生物科技，Y-116-131015）；布渣葉對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，QUZL-8E3N）。

表1　布渣葉藥材樣品來源表

1. 4 方法

1. 4. 1 色譜條件 色譜儀：ACQUITY UPLC（Waters）；色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（2. 1 mm×100 mm，1. 7 μm）；流動相：流動相A為0. 1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，按表2進行梯度洗脫；柱溫：20℃；流速：0. 3 mL／min；檢測波長：278 nm；進樣量：2 L。

表2　梯度洗脫條件

1. 4. 2 對照品溶液的制備 精密稱取牡荊苷、異牡荊苷適量，加入100%甲醇溶解，配成每1 mL含0. 1 g的混合對照品溶液，即得。

1. 4. 3 供試品溶液的制備 取各批次布渣葉樣品粉末（過40目篩）約1 g，置于50 mL離心管中，精密加入100%甲醇20 mL，稱定重量，超聲（220 W，40 kHz）60 min，冷卻，用100%甲醇補足減少的重量，以3 000 r／min離心5 min，取上清液1 mL至2 mL離心管中，再以12 000 r／min離心10 min，取上清液，即得。

圖1　22批藥材樣品UPLC色譜圖

圖2　對照品UPLC色譜圖

圖3　典型布渣葉UPLC指紋圖譜

2　結果

2. 1 精密度試驗 取同一份布渣葉樣品供試品溶液（3號樣品），連續進樣3次。記錄主要色譜峰保留時間和峰面積，各色譜峰保貿時間RSD為0. 02% ～0. 19%；各色譜峰峰面積RSD為3. 08%～8. 04%。結果表明儀器精密度良好。

2. 2 穩定性試驗 取同一份布渣葉供試品溶液（3號樣品）分別在0、2、4、8、12、24、48 h進樣分析。記錄主要色譜峰保留時間和峰面積，各色譜峰保貿時間RSD為0. 09%～0. 42%；各色譜峰峰面積RSD 為3. 33%～8. 58%。結果表明各成分在48 h內性質穩定。

2. 3 重復性試驗 取同一批次的布渣葉樣品粉末3份（3號樣品），分別按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進樣分析。記錄主要色譜峰保留時間和峰面積，各色譜峰保留時間RSD為0. 04%～3. 23%；各色譜峰峰面積RSD為0. 44%～7. 43%。結果表明試驗重復性良好。

2. 4 布渣葉指紋圖譜分析

2. 4. 1 布渣葉指紋圖譜建立 取布渣葉藥材21批以及對照藥材，共22批，按1. 4. 3項下制備供試品溶液，以1. 4. 1項色譜條件檢測，得22批樣品（含對照藥材和偽品）色譜圖，見圖1。取對照品溶液，以相同條件檢測，見圖2。從圖1可明顯看出10號樣品為偽品，18～21號樣品為新鮮采摘后冷凍干燥品，圖譜與其他布渣葉樣品的比較有差異。從其余17批樣品中可見典型布渣葉UPLC指紋圖譜，存在11個共有峰，根據對照品色譜圖，指認出其中2個共有峰，分別為牡荊苷、異牡荊苷，見圖3。

2. 4. 2 共有峰相對保留時間和相對峰面積計算

以6號共有峰為參照，分別計算各批布渣葉樣品和對照藥材圖譜中11個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表3、表4。結果顯示11個共有峰的相對保留時間RSD小于1%，共有峰的平均相對保留時間（min）為：0. 36、0. 46、0. 61、0. 63、0. 78、1. 00（牡荊苷）、1. 03（異牡荊苷）、1. 24、1. 45、1. 54、 1. 61。11個共有峰的相對峰面積變異較大，顯示不同來源的布渣葉樣品之間，其質量差異較大。

表3　11個共有峰的相對保留時間

表4　11個共有峰的相對峰面積

表5　布渣葉色譜圖與對照藥材色譜圖相似度計算

2. 4. 3 相似度分析 把21批布渣葉樣品色譜圖導入中藥色譜圖分析和數據管理系統軟件，以對照藥材為參照圖譜，用全圖譜夾角余弦法計算各樣品與之的相似度，見表5。結果顯示10號樣品的相似度明顯低于其他樣品，支持10號樣品為偽品的結論。

2. 4. 4 主成分分析 把22批（含對照藥材）布渣葉指紋圖譜導入IBM SPSS 21 Statistics軟件對數據進行主成分分析，見圖4。由于10號樣品外觀性狀上與正品布渣葉也存在明顯不同，可明確其為偽品。主成分分析結果顯示10號樣品的指紋圖譜特征明顯與其他樣品不同，本研究所建立的化學指紋圖譜明顯可以區分布渣葉偽品。同時，相似度分析結果與主成分分析結果一致，2種方法得到了相互驗證。見圖4。

圖4　22批（含對照藥材）布渣葉主成分分析結果

3　討論

實驗對色譜條件和樣品制備方法進行了考察。色譜檢測采用DAD檢測器作全波長掃描，其中278 nm，色譜峰較多，峰面積較大，峰形較好，色譜信息豐富，故選擇278 nm作為檢測波長。

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液3種流動相系統，發現乙腈-甲酸水溶液系統色譜峰信息最為豐富，并最終選擇乙腈-0. 1%甲酸水溶液作為流動相。另甲醇-水系統會導致柱壓較高，縮短色譜柱使用壽命，不建議使用。

實驗還考察了柱溫分別為20℃、30℃、40℃時對色譜圖的影響，發現隨著柱溫升高，保留時間減少，部分色譜峰峰面積減少甚至消失，綜合考慮，選擇20℃作為柱溫。

在樣品制備方面，比較了用不同濃度甲醇提取樣品和不同提取方法對色譜圖的影響。當中以100%甲醇提取樣品所得的色譜圖色譜峰最多，峰面積最大，選定為提取溶劑。又考察了超聲與加熱回流兩種提取方法，發現無明顯差異，由于超聲方法操作較為簡便，故選作為樣品提取方法，超聲時間為60 min。

本研究采用超高效液相色譜法對21批布渣葉樣品進行分析，建立布渣葉指紋圖譜，通過相似度計算和主成分分析對指紋圖譜進行評價，結果表明實驗方法通過方法學考察，結果良好，成功建立了布渣葉超高效液相指紋圖譜，確立了11個共有峰。圖譜評價，結果發現10號樣品相似度明顯較其他樣品低，主成分分析亦表明10號樣品與其他樣存在較大差異，兩種評價方法結果一致。因此該方法能從布渣葉樣品中把偽品區分開來，達到鑒別和質量控制的目的。

觀察圖1可得不同布渣葉樣品之間色譜峰差異主要體現在25～40 min這段時間內，表明出該部份化學成分及其含量的不同，在比較藥材粉末后發現，不同樣品粉末顏色有所不同，從褐至墨綠不等，這提示成分差異可能與植物色素或其他物質有關。

另外，四批新鮮采摘后經冷凍干燥的18～21號樣品相似度相對較低，原因可能與采收時間和干燥方法有關。

中藥指紋圖譜與以往的單一成分檢測相比較，更能體現中藥的復雜性和整體性，更好地中藥質量進行評價。現時中藥色譜指紋圖譜中以高效液相色譜法的研究較多，已有關于布渣葉高效液相指紋圖譜的文獻報道［11］。本次研究運用的超高效液相色譜法較以往的高效液相色譜法具有分析時間短，分離度、靈敏度高的優點，研究應用前景廣闊［12］。本研究建立的布渣葉超高效液相指紋圖譜經過方法學驗證，有良好的穩定性和重現性，為布渣葉質量控制的進一步研究提供理論依據。

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（2015－05－25收稿 責任編輯：張文婷）

思路與方法

中圖分類號：R285. 5

文獻標識碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 040

通信作者：趙中振，男，博士，教授，研究方向：中藥鑒定和中藥品質控制方面的研究，Tel：（00852）34112424；E-mail：zzzhao＠hkbu. edu. hk

作者簡介：陳偉韜（1990—），男，碩士，研究方向：中藥質量分析的研究；E-mail：chenwt009＠126. com

基金項目：廣東省中醫藥局建設中醫藥強省項目（編號：20142012）