馬甲子葉提取物抗腫瘤活性部位的篩選

武蕊娟譚 鐳詹 雁阮 佳徐 超

（1成都中醫藥大學，成都，610075；2四川省中醫藥科學院，成都，610041）

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馬甲子葉提取物抗腫瘤活性部位的篩選

武蕊娟1，2譚 鐳2詹 雁2阮 佳2徐 超2

（1成都中醫藥大學，成都，610075；2四川省中醫藥科學院，成都，610041）

摘要目的：從藥用植物馬甲子葉醇提物中分離篩選具有抗腫瘤作用的活性組分。方法：采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取馬甲子葉醇提物，并將這三個萃取部位進行體外抗腫瘤實驗，再把篩選得到的具有較好抗腫瘤活性的部位進行硅膠柱層析分離，并采用MTT法對分離得到的組分進行體外抗腫瘤活性比較。結果：通過體外抗HepG-2細胞和HeLa細胞實驗表明，乙酸乙酯萃取部位具有較好抗腫瘤活性。通過硅膠柱分離，獲得5個組分，通過MTT實驗發現這5個組分中，石油醚：乙酸乙酯為1∶1和1∶2洗脫所得到的兩個組分具有明顯的體外抗腫瘤活性，其中石油醚：乙酸乙酯為1∶2的洗脫具有更好的殺傷作用，對HepG-2細胞和HeLa細胞的IC50分別為45. 79，13. 16 μg／mL。結論：從馬甲子葉醇提物乙酸乙酯部位中分離得到2種具有抗腫瘤作用的活性組分，為進一步分離抗腫瘤活性成分提供一定的指導作用。

關鍵詞馬甲子葉提取物；抗腫瘤活性；溶劑法和硅膠柱分離法；MTT；活性組分

Study of Effectlve Antl-tumor Actlvlty Parts from Leaves of Pallurus ramoslsslmus

Wu Ruijuan1，2，Tan Lei2，Zhan Yan2，Ruan Jia2，Xu Chaoqun2
（1 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China；2 Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China）

Abstract Objectlve：To separate and select anti-tumor activity part from the leaves of Paliurus ramosissimus. Methods：Extracts from the leaves of Paliurus ramosissimus were extracted with petroleum ether，ethyl acetate and n-butyl alcohol respectively. In vitro anti-tumor experiments were performed at the three extract sites. The optimal site with best anti-tumor activity then was screened by silica gel column chromatography，and MTT assay was used for the comparison of components obtained for antitumor activity. Results：In vitro anti HepG-2 cells and HeLa cell experiments showed that ethyl acetate fraction extracts had good antitumor activity. Separated by a silica gel column，five components were collected by MTT assay，which found that when the ratio of petroleum ether：ethyl acetate were 1∶1 and 1∶2，both eluted fraction group had in vitro anti-tumor activity and when the ration of the elution of petroleum ether to ethyl acetate was 1∶2 the anti-tumor function was better. IC50of HepG-2 cells and HeLa cells were 45. 79 and 13. 16 μg·mL-1 respectively. Concluslon：Two kinds of active ingredients with anti-tumor effect were separated from the leaves of Paliurus ramosissimus by ethyl alcohol，which may provide guidance for the further separation of anti-tumor active ingredient.

Key Words Extracts from the leaves of Paliurus ramosissimus；Anti-tumor effect；Solvent and silica gel column separation；MTT；Active ingredient

馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir.系鼠李科馬甲子屬植物，又名鐵籬笆、銅錢樹。在我國長江流域以南各省均有分布，多生于丘陵林邊灌叢中或荒山草地上。其根、果實、葉均可供藥用，根能除寒活血，解熱消腫，治療跌打損傷及心腹疼痛；果實能化瘀止血，活血止痛，臺灣地區民間用于治療牙痛和腹痛［1-2］；葉能治療無名腫痛，民間多用于治癰瘡潰瘍等。也有報道證實馬甲子醇提物具有鎮咳祛痰的功效［3-4］。經課題組的前期研究證實其葉也具有抗腫瘤方面的作用且療效較好。此次實驗主要從馬甲子葉醇提物中分離出具有抗腫瘤作用的活性組分，對其中活性成分進行活性追蹤并分離純化，為闡明馬甲子的抗腫瘤作用機制奠定物質基礎。

1　材料與方法

1. 1 藥材 馬甲子鮮葉，于2014年5月7日采于四川省成都市牧馬山，經四川省中醫藥科學院舒光明研究員鑒定為鼠李科馬甲子屬植物馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir的鮮葉。

1. 2 藥品與試劑 DMEM／HIGH GLUCOSE培養基，胎牛血清（Hyclone，美國），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），青霉素、鏈霉素（Amresco，美國），胰蛋白酶（Gibco，美國），其他試劑均為分析純。人肝癌細胞HepG-2、人宮頸癌細胞HeLa（四川大學華西藥學院靶向藥物及釋藥系統教育部重點實驗室提供），96孔板。

1. 3 儀器 Thermo Forma系列CO2培養箱（Sanyo，日本）；Model-550型酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad，美國）；SW-CJ-2D型超凈工作臺（蘇州市凈化設備總廠）；倒置顯微鏡（型號：Fx-35DX，Nikon）；離心機（型號：TGL-16G，上海醫用分析儀器廠）。

2　方法［5-10］

2. 1 溶劑法和硅膠柱分離法提取不同組分 稱取馬甲子鮮葉適量，粉碎，用10倍量95%乙醇浸漬提取2 d，過濾，減壓濃縮，濃縮液冷凍干燥得馬甲子葉醇提物。馬甲子葉醇提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到以上3個部位及水溶液層，將各溶劑揮干，備用。將以上萃取得到的乙酸乙酯部位采用硅膠柱色譜分離，分別用石油醚：乙酸乙酯為15∶1，5∶1，3∶1，1∶1和1∶2配制的不同極性溶劑洗脫得到5個組分（Pl，P2，P3，P4和P5），蒸去溶劑，備用。

2. 2 MTT法測細胞增殖的抑制率 樣品配制：馬甲子各萃取部位和乙酸乙酯部位不同組分分別用異丙醇超聲溶解，1 000 r／min離心2次，0. 22 μm微孔濾膜過濾除菌，用培養基稀釋至所需濃度，備用。

按文獻方法［11-12］復蘇兩種細胞，常規培養。取對數生長期的HepG-2、HeLa細胞，均制備成濃度為6. 25×104個／mL的單細胞懸液，接種于96孔板，每孔160 L（即每孔接種1. 0×104個細胞），37℃、5% CO2培養箱培養至細胞貼壁后，加入不同濃度的藥物，設陽性對照0. 025 mg／mL 5-Fu注射液、陰性對照、空白對照組，復孔4個，繼續培養48 h。吸去上清液，用含0. 5 mg／mL MTT的無血清DMEM孵育3 h后，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，在酶標儀上于490 nm處檢測各吸光度OD值。實驗重復3次。按下列公式計算細胞生長抑制率：

抑制率＝1-（實驗組OD值-空白對照組OD值）／（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）× 100%。

表1　馬甲子醇提物不同萃取部位作用于HepG-2細胞24 h的實驗結果

表2　馬甲子醇提物不同萃取部位作用于HeLa細胞24 h的實驗結果

表3　馬甲子醇提物乙酸乙酯部位不同組分作用于HepG-2細胞24 h的實驗結果

表4　馬甲子醇提物乙酸乙酯部位不同組分作用于HeLa細胞24 h的實驗結果

3　結果

3. 1 不同極性部位對HepG-2細胞、Hela細胞增殖的抑制作用 實驗結果顯示，馬甲子石油醚和乙酸乙酯部位對HepG-2和HeLa細胞的增殖有較強的抑制作用，正丁醇及水溶液部分則無明顯作用。石油醚部位作用于HepG-2和HeLa細胞24 h的IC50分別為223. 17，180. 80 g／mL；乙酸乙酯部位作用于HepG-2和HeLa細胞24 h的IC50分別為138. 29，125. 11 g／mL。2個部位對HepG-2和Hela細胞增殖抑制率有明顯的量效關系。水提物部位對2種細胞體外增值均無明顯的抑制作用，正丁醇部位在最大濃度400 g／mL才有抑制作用。

3. 2 不同組分對HepG-2細胞、HeLa細胞增殖的抑制作用 乙酸乙酯部位采用硅膠柱層析分離得到的5個組分中，P4和P5 2個組分對HepG-2、Hela細胞增殖具有顯著的抑制作用。其中P4組分抑制HepG-2和HeLa細胞24 h的IC50分別為62. 91，45. 79 g／mL。P5組分抑制HepG-細胞和HeLa細胞24 h的IC50分別為26. 11，13. 16 g／mL。

圖1　不同組分對HepG-2和HeLa細胞增殖的抑制曲線

4　討論

本實驗以人肝癌細胞HepG-2和人子宮頸癌細胞HeLa的體外抗腫瘤活性為指標，用不同極性溶劑對馬甲子醇提物進行萃取分離得到的4個溶劑部位，并對4個溶劑部位采用MTT法測定抗腫瘤活性。實驗結果表明，石油醚和乙酸乙酯部位的抗腫瘤活性較明顯，其中乙酸乙酯部位的抗腫瘤活性最強。故將乙酸乙酯部位過硅膠柱層析分離，洗脫得到5個組分，得到活性較好的P4和P5組分，為馬甲子分離得到有效抗腫瘤活性單體提供了有效的實驗基礎。

由于中藥活性成份多而復雜，并且成份之間有可能存在相互作用，作用機制也各有不同。目前研究表明，應用中藥和其中的有效成分預防和治療腫瘤可以達到更好的效果。目前對馬甲子的研究主要集中在其根、莖、果實中化學成分的分離鑒定，而馬甲子葉中化學成分的研究還未見報道［13-15］，課題組擬對馬甲子的抗腫瘤藥效物質基礎及其作用機制進行深入研究，為進一步將馬甲子開發成一個新的抗腫瘤藥物提供實驗依據。

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（2015－06－16收稿 責任編輯：張文婷）

中圖分類號：R284. 2

文獻標識碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 038

通信作者：徐超群（1963. 09—），女，博士，研究員，研究方向：中藥新藥與新型給藥系統研究，E-mail：chaoqun_xu＠sina. com

作者簡介：武蕊娟（1989. 08—），女，碩士在讀，研究方向：中藥新藥與新型給藥系統研究，E-mail：344354319＠qq. com

基金項目：四川省科技支撐計劃（編號：15ZC1978）；四川省科研院所科技成果轉化資金項目（編號：14010139）；四川省公益性科研院所基本科研業務專項