石斛合劑等降糖中藥方對衰老糖尿病大鼠胰腺PCNA、NF-κBp65的影響

王曉寧鄭燕芳余文珍高尤亮楊秀珍林 雅張捷平劉如玉何才姑李長征鄭良樸施 紅

（1福建中醫(yī)藥大學，福州，350122；2福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福州，350003；3江蘇省泰州市人民醫(yī)院，泰州，225300）

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石斛合劑等降糖中藥方對衰老糖尿病大鼠胰腺PCNA、NF-κBp65的影響

王曉寧1鄭燕芳1余文珍1高尤亮2楊秀珍3林 雅1張捷平1劉如玉1何才姑1李長征1鄭良樸1施 紅1

（1福建中醫(yī)藥大學，福州，350122；2福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福州，350003；3江蘇省泰州市人民醫(yī)院，泰州，225300）

摘要目的：比較石斛合劑等降糖中藥方對衰老糖尿病模型大鼠胰島細胞增殖凋亡相關(guān)因子PCNA、NF-κBp65的影響，以遴選出保護胰島細胞功能、防治老年糖尿病的方藥。方法：采用Wistar雌性大鼠制備衰老DM模型大鼠，隨機分為：衰老對照組、衰老DM模型組、衰老DM石斛合劑組、衰老DM生脈散組，并給予藥物治療4周后，檢測血清FBG、GSP等濃度；免疫組化法檢測胰腺組織中PCNA和NF-κBp65的表達。結(jié)果：與衰老DM模型組相比：石斛合劑組大鼠FBG與GSP顯著降低（P＜0. 05～0. 01），生脈散組亦降低；且治療組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01）；石斛合劑組胰腺PCNA表達非常顯著（P＜0. 01），生脈散組表達亦增加（P＜0. 05），2個治療組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01）；但治療組該2項指標均未達到衰老對照組水平。各組胰島內(nèi)NF-κBp65表達由多到少順序依次如下：石斛合劑組＞衰老DM模型組＞生脈散組＞衰老對照組。結(jié)論：與生脈散相比，石斛合劑能夠更明顯地改善衰老DM大鼠血糖；二者均能促使DM大鼠胰腺組織PCNA表達，提示其可促使胰腺細胞增殖，改善被破壞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，呈現(xiàn)石斛合劑＞生脈散的趨勢。各組胰島內(nèi)NF-κBp65表達由多到少順序依次如下：石斛合劑組＞衰老DM模型組＞生脈散組＞衰老對照組。推測：患DM后，機體產(chǎn)生應激反應，石斛合劑可以促使NF-κB參與應激反應，調(diào)動了機體潛力；生脈散則減弱NF-κB參與應激反應。在防治老年糖尿病方面，石斛合劑較生脈散更具優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞衰老糖尿病模型；胰腺；PCNA；NF-κBp65；石斛合劑

Effects of Shlhu Compound wlth Blood Glucose Decllne Chlnese Medlclne on PCNA and NF-κBp65 Expresslons ln Pancreas of Aged Dlabetes Mellltus Model Rats

Wang Xiaoning1，Zheng Yanfang1，Yu Wenzhen1，Gao Youliang2，Yang Xiuzhen3，Lin Ya1，Zhang Jieping1，
Liu Ruyu1，He Caigu1，Li Changzheng1，Zheng Liangpu1，Shi Hong1
（1 Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)ujian 350122，China；2 The Second People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)ujian 350003，China；3 Taizhou People's Hospital of Jiangsu Province，Taizhou 225300，China）

Abstract Objectlve：To observe the effect of Shihu Compound（DC）and other Chinese medicine on declining blood glucose and their effects on PCNA and NF-κBp65 of aged diabetes Mellitus model rats. Methods：The aged diabetic model rats were divided into control group，model group，DC group and PRPB（Shengmai San）group. They were given drugs for four weeks. The concentrations of FBG and GSP in sernm were measured，and the PCNA and NF-κBp65 in pancreas of aged diabetic rats were assayed by immunohistochemistry. Results：Compared with the model group，the level of FBG and GSP decreased in DC group and PRPB group（P＜0. 01）. And PCNA expression was evidently heightened in the two treatment group，and there were significant differences between the two groups（P＜0. 01）. The level of FBG and GSP and the PCNA expression has not reach the level of that of the aged control group. The NF-κBp65 expression in pancreas was DC treated group＞aged DM model group＞PRPB treated group ＞aged control group. Concluslon：DC could more significantly improve the blood glucose and enhance PCNA expression in model group than PRPB group. DC could better improve the internal environment homeostasis in aged diabetic rats via promoting the pancreatic cell proliferation than PRPB. It could be deduced that DC enables NF-κB to involve in stress response in DM and mobilize the body potential，but PRPB functions the contrary. DC has better effect in treating aged DM than PRPB.

Key Words Aged DM model；Pancreas；PCNA；NF-κBp65；Shihu compound

我國2010年大規(guī)模人群的糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）研究表明，糖尿病及糖尿病前期患病率分別為11. 6%和50. 1%［1］，國外流行病學研究顯示，65～74歲之間，糖耐量異常，加之未診斷的和確診的DM患者可高達40%［2］。據(jù)聯(lián)合國估計，到2025年，全世界60歲以上的老年人將達11億，占總?cè)丝诘?3. 7%，我國將達20%，約有2. 8億老年人，隨之老年糖尿病患病率將大幅度增加。國內(nèi)外均在積極研究防治老年糖尿病的藥物和方法。目前臨床研究已證明石斛合劑、生脈散等中藥方對老年DM有一定療效，本研究擬從胰島細胞增殖、凋亡相關(guān)重要因子PCNA、NF-κBp65表達的情況對上述2方進行比較，以遴選出保護胰島細胞功能、防治老年糖尿病的方藥。

1　材料與方法

1. 1 實驗動物 清潔級健康Wistar雌性大鼠78只（體重140～160 g／只，3個月齡），購自上海斯萊克實驗動物有限公司（批號0008131）。動物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心，室溫20～23℃，空氣流通，相對濕度55%～70%，12 h光照維持，晝夜循環(huán)。以福建中醫(yī)藥大學動物中心提供的顆粒飼料及自制高脂高糖飼料進行喂養(yǎng)，自由攝食、飲水，保持墊料干燥，每日定時更換。

1. 2 試劑 D-半乳糖（上海試劑二廠），膽酸鈉、膽固醇（武漢亞法生物技術(shù)有限公司），鏈脲佐菌素（STZ）（美國ALEXIS公司），PCNA、NF-κB p65（武漢博士德生物工程有限公司），血糖、GSP（南京建成生物工程研究所）。

1. 3 石斛合劑 各中藥方煎后均經(jīng)過濾，濃縮至流浸膏，乙醇醇提，濾過，回收乙醇，最終濾液加水分別調(diào)至含生藥量石斛合劑6. 4 g／mL、復方丹參7. 0 g／mL、生脈散5. 5 g／mL，分裝滅菌，100 mL／瓶。

1. 4 分組及給藥方法 根據(jù)國家衛(wèi)生部關(guān)于中藥新藥治療DM的臨床指導原則［3］，參考《中藥藥理研究方法學》（人民衛(wèi)生出版社，1994版）、孫敬方主編《動物實驗方法學》及有關(guān)文獻［4-6］，選用課題組前期研究造模方法［7］制備衰老DM模型大鼠，實驗分組如下：衰老對照組（A）：腹腔注射D-半乳糖（50 mg／kg體重）42 d并給予普通飼料和NS灌胃（10只）；衰老DM糖尿病模型大鼠：腹腔注射D-半乳糖（50 mg／kg體重）連續(xù)42 d，從第13 d起給予高脂高糖飼料灌胃，連續(xù)30 d后腹腔注射STZ（體重＜200 g者按30 mg／kg體重計算，體重≥200 g者按體表面積計算）。將衰老糖尿病大鼠按體重、血糖隨機分為衰老DM模型組（B）（12只）、衰老DM石斛合劑組（C）（12只）、衰老DM生脈散組（D）（12只）中藥灌胃量均為1 mL／100 g（給藥量按大鼠與人體表比換算法計算，相當于臨床用量10倍），2次／d，連續(xù)治療4周。每日觀察大鼠精神狀態(tài)、毛色、活動情況、飲水量及進食量（測每組飲水、進食的總量，再以平均值作為每只的進食、飲水量），每周測1次體重。藥物治療結(jié)束后，戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，離心制備血清，－20℃保存待測。并取胰尾保存于Lille液中，以行免疫組化。

注：因課題組前期實驗已證實石斛合劑與生脈散中劑量組效果優(yōu)于高、低劑量組，故本實驗不設(shè)高、低劑量組，所用劑量為中劑量。且目前未發(fā)現(xiàn)有明顯療效的抗衰老糖尿病的西藥或中成藥，故不設(shè)陽性對照組。

1. 5 指標觀察

1. 5. 1 血清學指標 采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖（FBG），果糖胺法測定糖化血清蛋白GSP。

1. 5. 2 免疫組織化學法檢測 胰腺組織中增殖細胞核抗原（PCNA）與NF-κB亞基p65的表達：采用卵白素—生物素—辣根過氧化物酶復合物——Avidin Biotin Complex簡稱ABC法。PCNA觀察：細胞核棕染的為陽性細胞，高倍鏡下選5個視野計數(shù)單位面積胰腺組織中陽性細胞個數(shù)，取平均值；NF-κB亞基p65觀察：胞漿棕染為陽性細胞。高倍鏡下選5個胰島攝像，采用CMIAS型彩色病理圖像分析儀計算NF-κB亞基p65表達的積分光密度（A）值。

1. 6 統(tǒng)計方法 所有資料均采用SPSS 11. 5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析。計量資料間比較用t檢驗和t'檢驗。

2　結(jié)果

2. 1 各組大鼠一般情況及各中藥方對其血清FBG、GSP的影響 衰老對照組大鼠飲食飲水（飲水量43 mL／只·d，進食量15 g／只·d）及大小便正常，活動較正常，體毛濃密有澤，體重增長明顯。衰老DM模型組大鼠多飲、多尿、活動減少，體毛松散無澤等癥狀未緩解，體重明顯降低，精神萎靡，死亡3只；各治療組大鼠三多癥狀均有一定程度改善（飲水量62 mL／只·d，進食量18 g／只·d），較衰老DM模型組活躍、體重呈有一定程度增加，各治療組之間無明顯區(qū)別（P＞0. 05）。石斛合劑（C）組大鼠FBG與GSP顯著降低（見表1）。各治療組比較，石斛合劑（C）組與生脈散（D）組之間有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01），可見，石斛合劑降糖療效（數(shù)據(jù)參考已發(fā)表文章［8］較生脈散更明顯，但未達到衰老對照組大鼠水平（P＜0. 01）。

表1　各組大鼠空腹血糖（FBG）、糖化血清蛋白（GSP）的變化（±s）

表1　各組大鼠空腹血糖（FBG）、糖化血清蛋白（GSP）的變化（±s）

注：*表示與A組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 05），**表示與A組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01）；△表示與B組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 05），△△表示與B組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01）。

組別　　只數(shù)　FBG（mmol／L）　GSP（mg／mL）A　 10　3. 57±1. 061　0. 155±0. 040 B　 12　24. 2±5. 042**　0. 234±0. 060**C　 12　8. 49±1. 973**△△　0. 186±0. 034△D　 . 12　20. 6±3. 281**△　0. 193±0. 051*

2. 2 各中藥方對大鼠胰腺組織中PCNA表達的影響 由圖1可知，衰老對照（A）組可觀察到大片核著棕褐色的PCNA陽性細胞。衰老DM對照（B）組只見極少數(shù)核著棕褐色的PCNA陽性細胞。各治療組可見到核著棕褐色的PCNA陽性細胞，石斛合劑（C）組可見到大量PCNA陽性細胞，較衰老DM對照組增加，但未及衰老對照（A）組陽性細胞數(shù)。生脈散（D）組可見少量的PCNA陽性細胞。由表2可知，關(guān)于PCNA：與衰老對照（A）組比較，衰老DM模型（B）組PCNA陽性細胞個數(shù)明顯減少（P＜0. 01）。經(jīng)治療后，與衰老DM模型（B）組相比，石斛合劑可非常顯著地促進胰腺組織中PCNA表達（P＜0. 01），生脈散也可促其表達（P＜0. 05）。2治療組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01），因此可見，石斛合劑較生脈散療效更明顯，但未達到衰老對照組大鼠水平（P均＜0. 01）。中藥方石斛合劑與生脈散能促使衰老DM大鼠胰腺組織中PCNA表達，提示二者可促使胰腺細胞增殖，但其療效是石斛合劑＞生脈散。

2. 3 各中藥方對大鼠胰島中NF-κBp65表達的影響

由圖2可知，免疫組化染色胞漿中著棕黃色片狀者為NF-κB亞基p65陽性。衰老對照（A）組胰島可見少量胰島細胞胞漿棕染。與衰老對照（A）組比較，各治療組均比衰老對照（A）組陽性細胞多；其中石斛合劑（C）組胰島內(nèi)胞漿棕染細胞最多。生脈散（D）組中可見到較少量的陽性細胞。與衰老DM模型（B）組相比，石斛合劑（C）組所含陽性細胞數(shù)增多（P＜0. 01），但生脈散（D）組則較少（P＜0. 05）。由表2可知，與衰老對照（A）組比較，衰老DM模型（B）組、石斛合劑（C）組及生脈散（D）組均差異均有統(tǒng)讓學意義（P均＜0. 01）；與衰老DM模型（B）組比較，石斛合劑（C）組表達非常明顯增加（P＜0. 01），但生脈散（D）組表達明顯減少（P＜0. 05）。各組胰島內(nèi)NF-κBp65表達由多到少順序依次如下：石斛合劑（C）組＞衰老DM模型（B）組＞生脈散（D）組＞衰老對照（A）組。推測：患DM后，機體產(chǎn)生應激反應，石斛合劑可以促使NF-κB參與應激反應，調(diào)動了機體潛力；生脈散則減弱NF-κB參與應激反應。

圖1　各組大鼠胰腺組織中PCNA表達觀察（免疫組化圖片）

圖2　各組大鼠胰島中NF-κB亞基p65表達觀察（免疫組化圖片）

表2　各組大鼠胰腺組織PCNAS和NF-κB亞基p65表達變化的比較±s）

表2　各組大鼠胰腺組織PCNAS和NF-κB亞基p65表達變化的比較±s）

注：*表示與A組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 05），**表示與A組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01）；△表示與B組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 05），△△表示與B組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0. 01）。

組別　只數(shù)　PCNA陽性細胞數(shù)　p65陽性目標積分光密度A　 8　168. 32±2. 13　0. 252±0. 016 B　 8　142. 94±3. 19**　0. 418±0. 081**C　 8　162. 28±2. 68**△△　0. 524±0. 121**△△D　 8　146. 80±2. 77**△　0. 309±0. 083△

3　討論

胰島β細胞功能失調(diào)和胰島素抵抗是老年糖尿病的2個重要發(fā)病機制。研究表明，患DM后，胰島素抵抗不再繼續(xù)加重，而胰島β細胞數(shù)量減少、功能衰竭，成為DM進展的驅(qū)動力。結(jié)合老年病學研究：老年人隨著年齡增長，各組織器官發(fā)生衰老性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及生長停滯，神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)控功能退化或紊亂［9］，進而勢必影響細胞增殖與凋亡因子的表達，使衰老機體胰島細胞易發(fā)生分化增殖下降、凋亡增加、乃至二者失衡的內(nèi)環(huán)境紊亂現(xiàn)象。我國臨床長期使用的降糖西藥，顯示出對機體有較大的損害作用，尤其對器官、功能逐漸衰退的老年人，不良反應更多。已有報道提出，磺脲類優(yōu)降糖在降低血糖的同時，可促使大鼠和人的胰島細胞凋亡，無法根本遏制β細胞功能進行性衰竭。

中醫(yī)學中DM屬于“消渴病”范疇，老年DM呈現(xiàn)陰陽失調(diào)、氣血虧虛、臟腑虛衰且夾瘀等特點。大量研究表明，中藥方石斛合劑、生脈散等均有治療DM及預防、治療或減輕DM患者慢性并發(fā)癥的作用。本研究從調(diào)控胰島細胞增殖、凋亡相關(guān)因子表達的角度，遴選出保護胰島細胞功能、防治老年糖尿病的有效方藥。

石斛合劑是以滋陰、益氣、活血治則所立之方。本課題組經(jīng)近30年臨床-基礎(chǔ)-臨床研究發(fā)現(xiàn)，石斛合劑能顯著降低高血糖大鼠空腹及自由進食血糖，降低胰高血糖素、升高和調(diào)節(jié)胰島素、C肽的分泌，升高胰島素／C肽比值，降低FFA、TNF-α水平，抑制α-葡萄糖苷酶；促進胰島增大及胰島β細胞增殖，作用尤為明顯，顯著優(yōu)于優(yōu)降糖和二甲雙胍以及中藥玉泉丸；另外，尚有降低三酰甘油、膽固醇，改善血黏度及血小板功能，調(diào)整和提高免疫功能，升高SOD，降低LPO，延緩衰老等作用。臨床應用發(fā)現(xiàn)，該方降糖療效穩(wěn)定，且可預防、減輕糖尿病并發(fā)癥［10-11］。本試驗的研究進一步提示石斛合劑能從保護胰島細胞功能角度防治糖尿病，具有重要理論和實際指導意義。

生脈散主要功效為益氣養(yǎng)陰、生津止渴。能滋補老年人的肺陰及心陰，具有多途徑調(diào)節(jié)糖基化代謝紊亂的作用?，F(xiàn)代藥理研究證明：人參所含人參皂苷及人參多糖有刺激胰島素分泌，激活、致敏胰島素受體，降低血糖水平。臨床觀察證實，源于古方生脈散的參麥注射液有很好的降糖作用，還能清除LPO、恢復SOD活性并改善機體微循環(huán)、脂質(zhì)代謝及組織缺氧的功能。加用參麥注射液的治療組在改善空腹血糖、餐后血糖及促進胰島素的基礎(chǔ)分泌方面均優(yōu)于對照組，體現(xiàn)出參麥注射液對NIDDM的臨床治療確有較好的運用價值［12］。

國外已有研究表明：DM動物表現(xiàn)為胰腺細胞增殖下降，凋亡增加，如細胞凋亡因子Bax、Caspase-3表達增加［13-14］，而抑制細胞凋亡、促進細胞增殖的因子Bcl-2、PCNA表達下降。涉及胰島細胞增殖、凋亡的因素眾多，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，其抑制凋亡的作用可能通過NF-κB和cAMP-PKA途徑共同調(diào)節(jié)；在應激狀態(tài)下（如創(chuàng)傷、氧化損傷、高脂高糖等），增殖和凋亡可能主要通過NF-κB途徑調(diào)節(jié)［15］，即通過NF-κB結(jié)合活性加強，促使其下游的iap-2（凋亡蛋白-2抑制物基因）及bcl-2表達增強來抑制凋亡。因此，NF-κB在介導DM胰島細胞的增殖、凋亡中至關(guān)重要。但NF-κB與胰島細胞增殖、凋亡的關(guān)系還不是很明確，仍存在爭議。而課題組前期研究已觀察了石斛合劑對Bax、Bcl-2表達的影響［16］，對Caspase-3表達的影響課題組其他人員正在研究，故本研究選取PCNA、NF-κB的亞基p65作為指標行胰腺組織免疫組化觀察。

PCNA——增殖細胞核抗原，其表達與DNA復制及細胞分裂增殖活性有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)DM可使小鼠睪丸組織中PCNA表達下降［17］，而DM腎病大鼠腎小球基底膜細胞PCNA表達增強。本實驗結(jié)果：中藥方石斛合劑與生脈散能促使衰老DM大鼠胰腺組織中PCNA表達，提示二者可促使胰腺細胞增殖，但其療效是石斛合劑＞生脈散。各組胰島內(nèi)NF-κBp65表達由多到少順序依次如下：石斛合劑（C）組＞衰老DM模型（B）組＞生脈散（D）組＞衰老對照（A）組。推測：患DM后，機體產(chǎn)生應激反應，石斛合劑可以促使NF-κB參與應激反應，調(diào)動了機體潛力；生脈散則減弱NF-κB參與應激反應。

綜合上述結(jié)果分析，石斛合劑較生脈散在控制衰老DM模型大鼠血糖、糖化血清蛋白和促進胰島細胞增殖等方面效果更佳，為石斛合劑臨床有效防治老年糖尿病、延緩其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展進一步提供理論依據(jù)。

為深入明確石斛合劑防治老年糖尿病的作用機制，尚需在其他信號途徑及上述指標的基因水平做進一步研究。

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（2015－11－22收稿 責任編輯：王明）

中圖分類號：book=109,ebook=114R285. 5

文獻標識碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 031

通信作者：施紅（1964. 04—），女，博士，博士研究生導師，教授，研究方向：主要從事中西醫(yī)結(jié)合延緩衰老及中醫(yī)藥防治糖尿病的研究工作，E-mail：shihong3327＠sina. com. cn

作者簡介：王曉寧（1980. 01—），女，碩士，講師，研究方向：主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病研究工作，E-mail：wxn1980_1＠sina. com

基金項目：福建中醫(yī)藥大學校管科研課題（編號：X2012017）；福建中醫(yī)藥大學重點學科專項校管課題（編號：X2014024-學科）；福建省中青年教師教育科研項目（一般項目A類科技項目）（編號：JA15240）；福建省自然科學基金項目（編號：2014J01354）