小兒喘寶對哮喘大鼠血清及肺泡灌洗液Th1／Th2平衡的影響

陳 誠 李 明 周耀庭 劉仁慧 師一民（首都醫科大學中醫藥學院，北京，100069）

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小兒喘寶對哮喘大鼠血清及肺泡灌洗液Th1／Th2平衡的影響

陳 誠 李 明 周耀庭 劉仁慧 師一民
（首都醫科大學中醫藥學院，北京，100069）

摘要目的：研究小兒喘寶對哮喘大鼠血清及肺泡灌洗液中Th1／Th2平衡的影響，探索其治療哮喘的作用機制。方法：采用卵蛋白（OVA）致敏、激發的方式制作大鼠慢性哮喘模型，以地塞米松為對照藥。通過對哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）細胞涂片中嗜酸性粒細胞（EOS）的計數，血清及肺泡灌洗液（BALF）中IFN-γ、IL-4含量以及IFN-γ／IL-4比值的測定，探索小兒喘寶治療哮喘大鼠的作用機制。結果：小兒喘寶可減輕大鼠的哮喘癥狀，減少BALF中EOS的數量，降低血清及BALF中IL-4的含量，升高血清及BALF中IFN-γ的含量，升高IFN-γ／IL-4的比值。結論：小兒喘寶能升高哮喘大鼠血清及肺泡灌洗液中IFN-γ／IL-4的比值，從而糾正失衡的Th1／Th2，這可能是小兒喘寶調節哮喘的作用機制之一。

關鍵詞小兒喘寶；哮喘；Th1／Th2

The Effect of Xlao'er Chuanbao Decoctlon on the Balance of Th1／Th2 ln Serum and Bronchoalveo Larlavage Fluld of Asthma Rats

Chen Cheng，Li Ming，Zhou Yaoting，Liu Renhui，Shi Yimin
（Traditional Chinese Medicine School of Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Abstract Objectlve：To investigate the effects of Xiao'er Chuanbao decoction on Th1／Th2 balance in asthma rats and its mechanism. Methods：To make the chronic asthma models by Ovalbumin（OVA）sensitizing and stimulating. Dexamethasone was used as the control drug. To explore the mechanism of Xiao'er Chuanbao decoction in treating asthmatic rats by counting the number of eosinophils（EOS）in bronchoalveo larlavage fluid（BALF），determining the contents of IFN-γ，IL-4 in serum and BALF，and calculating the ratio of IFN-γ and IL-4. Results：Xiao'er Chuanbao decoction can relieve asthma symptoms reduce the number of EOS in BALF，raise the level of IL-4 in serum and BALF deduce the level of IFN-γ and increase IFN-γ／IL-4 ratio. Concluslon：Xiao'er chuanbao decoction can rise the ratio of IFN-γ／IL-4，and thus balancing Th1／Th2. This might be its mechanism in treating asthma.

Key Words Xiao'er Chuanbao decoction；Asthma；Th1／Th2

兒童支氣管哮喘是嚴重威脅兒童身體健康的疾病之一，近年來由于自然環境和生活習慣的改變，該病在我國呈現明顯的上升趨勢。目前，在我國有約1 000萬左右的兒童罹患該病［1］。國家級名老中醫周耀庭教授在兒童支氣管哮喘的發病及治療方面具有獨到見解，強調治療兒童支氣管哮喘應始終貫徹“祛痰蠲飲”的治療方針。其創制的小兒喘寶是以麻黃、黃芩、瓜蔞、代赭石等藥物為主組成的復方，在前期臨床運用中獲得顯著療效［2］。為進一步明確小兒喘寶治療哮喘的作用機制，本實驗將從其對血清和肺泡灌洗液中Th1／Th2平衡的影響角度進行研究。

1　資料與方法

1. 1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，36只，體重（180±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司購入，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。各組大鼠喂養常規飼料，自由進食飲水，適應性飼養3 d。

1. 2 實驗藥物 “小兒喘寶”，麻黃、黃芩、瓜蔞、代赭石等，均購自北京同仁堂店，水煎。其中小兒喘寶高劑量為2. 42 g／mL、小兒喘寶中劑量1. 21 g／mL、小兒喘寶低劑量0. 605 g／mL。

醋酸地塞米松片，0. 75 mg／片×100，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：130309，配置成0. 05 g／mL水溶液。

1. 3 實驗試劑和儀器 卵蛋白（批號：SLBG1256V，Sigma）；氫氧化鋁（批號：201112261，北京化工廠）；IL-4Elisa試劑盒（批號：230440715，北京環亞泰克公司）；IFN-γElisa試劑盒（批號：238041231，北京環亞泰克公司）；402AI超聲霧化器（江蘇魚躍醫療設備有限公司）；Biofuge15R離心機（德國Heraeus公司）；MODEL680酶標儀（美國BIO-RAD公司）。

1. 4 動物造模與分組 實驗大鼠適應性飼養后，將其隨機分為6組，即正常對照組（A組）、哮喘模型組（B組）、激素組（C組）、小兒喘寶高劑量組（D組）、小兒喘寶中劑量組（E組）、小兒喘寶低劑量組（F組），每組6只。采用卵蛋白致敏和霧化激發的方式建立哮喘模型［3］。除A組外，其余各組分別于實驗的第1天、第8天用新鮮配制的卵蛋白100 mg＋氫氧化鋁200 mg＋生理鹽水1 mL的混懸液分別在大鼠兩側腹股溝、前足跖做皮下注射，每點0. 2 mL，同時腹腔注射0. 2 mL，共4點。再于實驗第15～35天，每天喂藥后分批將致敏的大鼠置于密閉容器內，給予1%卵蛋白生理鹽水進行超聲霧化吸入25 min／d，霧化流量為3 mL／min，連續21 d，以激發哮喘。在霧化過程，各組大鼠出現不同程度的煩躁不安、呼吸增快、腹肌抽搐等表現。正常對照組以等量生理鹽水進行兩側腹股溝、前足跖皮下注射、腹腔注射和霧化，方法同上。實驗第36天處死大鼠。

1. 5 給藥方法 從實驗第8天開始給各組大鼠灌胃給藥，1次／d。D、E、F組，分別給予小兒喘寶水煎液24 g、12 g、6 g生藥／（kg·d）。C組給予醋酸地塞米松溶液0. 5 mg／（kg·d）。A組和B組給予生理鹽水。以上各組大鼠的給藥量為1 mL／100 g.

1. 6 觀察指標與方法 實驗第36天，給藥后1 h，常規消毒，以10%水合氯醛3. 5 mL／kg對大鼠進行腹腔注射，待大鼠麻醉后，打開腹腔，腹主動脈取血，室溫靜置2 h后，以3 000 r／min的轉速離心20 min，取血清，用ELISA試劑盒測定血清中IL-4、IFN-γ的含量（pg／mL）。然后向上打開胸腔，向上剪開頸部皮膚，鈍性分離氣管，于環狀軟骨處剪斷氣管，將5 mL注射器的針管去除，套上藍色槍頭插入氣管，經氣管向肺葉注射冰的生理鹽水4 mL，輕輕按摩肺組織30 s后，緩慢回吸BALF，反復3次，回收率＞80%，將回收的BALF以1 500 r／min的轉速離心10 min，取上清液，用ELISA試劑盒測定血清中IL-4、IFN-γ的含量（pg／mL）。

1. 7 統計方法 運用SPSS 11. 5軟件包進行數據統計分析，數值采用（±s）表示，組間比較采用ANOVA分析，方差齊者用LSD檢驗，不齊者用Dunnett's T3檢驗，P＜0. 05為差異有統計學意義。

2　結果

2. 1 一般情況觀察 A組大鼠在受到激發后呼吸節律規整，活躍好動，毛色光澤，腹部正常起伏，無抽搐。B組大鼠受到激發后出現呼吸急促、加深加快，煩躁不安，咳嗽頻頻，撓鼻，反應遲緩，精神不振，毛色光澤差，并有脫毛，腹肌時有抽搐，腹式呼吸明顯，拱背蜷臥等癥狀。C組和D、E、F組大鼠受到激發后呼吸略微加快，反應較靈敏，略有煩躁、咳嗽，精神尚佳，毛色略顯暗淡，偶有腹肌抽搐。

2. 2 小兒喘寶對哮喘大鼠BALF細胞涂片中EOS數量的影響 與A組比較，B組細胞涂片里的EOS數量較A組顯著增多（P＜0. 01）；與B組比較，C組和E、F組EOS數量顯著減少（P＜0. 01）；與D組比較，F組EOS數量明顯減少（P＜0. 05）。見表1。

表1　大鼠BALF細胞涂片中EOS的變化（±s）

表1　大鼠BALF細胞涂片中EOS的變化（±s）

注：與A組比較△△P＜0. 01；與B組比較**P＜0. 01；與D組比較＃P＜0. 05。

組別　　例數　EOS數量／200細胞A組1. 08±0. 38 B組　6　2. 54±0. 46△△C組　6　1. 25±0. 69**D組　6　2. 08±0. 49 E組　6　1. 33±0. 41**F組　6　1. 17±0. 49**＃6

2. 3 小兒喘寶對哮喘大鼠血清中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的影響 與A組比較，B組血清中IFN-γ含量較正常組有顯著性降低（P＜0. 01）；與B組比較，C組和E、F組血清中IFN-γ含量有顯著性升高（P＜0. 01）；與D組比較，F組血清中IFN-γ含量有顯著性升高（P＜0. 01）；與E組比較，F組血清中IFN-γ含量有明顯升高（P＜0. 05）。與A比較，B組血清中IL-4含量較A組有顯著性升高（P＜0. 01）；與B組比較，C組和E、F組血清IL-4含量顯著性降低（P ＜0. 01），D組有明顯降低（P＜0. 05）；與D組比較，F組血清IL-4含量有明顯降低（P＜0. 05）。與A組比較，B組動物血清中IFN-γ／IL-4比值較A組有顯著性降低（P＜0. 01）；與B組相比，C組和F組血清中IFN-γ／IL-4比值有顯著性升高（P＜0. 01），E組血清中IFN-γ／IL-4比值有明顯升高（P＜0. 05）；與D組相比，F組血清中IFN-γ／IL-4比值有顯著性升高（P＜0. 01）。見表2。

2. 4 小兒喘寶對哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的影響 與A組比較，B組支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ含量較A組有顯著性降低（P＜0. 01）；與B組相比，F組支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ含量有顯著性升高（P＜0. 01），C組和E組支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ含量有明顯升高（P＜0. 05）；與D組比較，F組支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ含量有明顯升高（P＜0. 05）。與A組比較，B組支氣管肺泡灌洗液中IL-4含量較A組有顯著性升高（P＜0. 01）；與B組比較，C組和F組支氣管肺泡灌洗液中IL-4含量有顯著性降低（P＜0. 01），E組含量有明顯降低（P＜0. 05）；與D組比較，F組支氣管肺泡灌洗液中IL-4要明顯低于D組（P＜0. 05）。與A組比較，B組動物支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ／IL-4比值較A組有顯著性降低（P＜0. 01）；與B組相比，E、F組支氣管肺泡灌洗液中的IFN-γ／IL-4比值有顯著性升高（P＜0. 01），C組支氣管肺泡灌洗液中的IFN-γ／IL-4比值較B組有明顯升高（P＜0. 05）；與D組比較，F組支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ／IL-4比值有明顯升高（P＜0. 05）。見表3。

表2　大鼠血清中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的變化（±s）

表2　大鼠血清中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的變化（±s）

注：與A組比較△△P＜0. 01；與B組比較*P＜0. 05，**P＜0. 01；與D組比較＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01；與E組比較▲P＜0. 05。

組別例數　IFN-γ（pg／mL）　IL-4（pg／mL）　IFN-γ／IL-4 A組6　 147. 25±27. 65　 8. 58±4. 59　 7. 86±3. 32 B組　6　 59. 16±15. 32△△17. 74±2. 45△△3. 67±1. 24△△C組　6　 97. 66±32. 50**　7. 38±3. 33**7. 81±2. 42**D組　6　 73. 60±17. 22　 13. 52±2. 29*　5. 45±1. 12 E組　6　 94. 80±12. 70**11. 94±3. 68**6. 96±2. 04*F組　6　 121. 81±16. 13**＃＃▲8. 61±2. 60**＃9. 51±2. 93**＃＃

表3　大鼠支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的變化（-±s）

表3　大鼠支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4、IFN-γ／IL-4的變化（-±s）

注：與A組比較△△P＜0. 01；與B組比較*P＜0. 05，**P＜0. 01；與D組比較＃P＜0. 05。

組別例數　IFN-γ（pg／mL）　IL-4（pg／mL）　IFN-γ／IL-4 A組6　 96. 74±31. 76　 7. 37±2. 57　 9. 96±2. 64 B組　6　 46. 95±10. 83△△　14. 55±4. 43△△3. 40±1. 73△△C組　6　 73. 44±15. 07*　10. 12±2. 60**6. 68±2. 53*D組　6　 60. 81±17. 05　 11. 90±2. 17　 5. 80±1. 05 E組　6　 72. 66±24. 80*　10. 53±1. 56*　7. 18±2. 06**F組　6　 89. 51±18. 92**＃7. 96±1. 92**＃9. 45±2. 14**＃

3　討論

支氣管哮喘是由多種炎性細胞和炎性反應遞質介導的慢性呼吸道疾病，兒童哮喘主要表現為反復發作性喘息、呼吸困難、咳嗽、胸悶，發病機制極為復雜［4］。近來研究表明，哮喘的發病過程與Th活化并分泌多種細胞因子有密切聯系，正常情況下Th1和Th2細胞處于相對平衡的狀態，維持著機體的正常免疫功能［5］。目前普遍認為當機體受到異常抗原刺激后，Th1／Th2的正常平衡被打破，此時Th2細胞優勢分化、Th1細胞分化相對弱勢，就會出現炎性細胞的趨化、成熟、聚集，導致嚴重的炎性反應。因此，Th1／Th2失衡是哮喘發生的重要機制［6］。

Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子（TNF-α、TNF-β）等細胞因子，激活巨噬細胞，發生遲發超敏反應；Th2細胞主要產生IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細胞因子，誘導嗜酸性粒細胞募集，引起氣道炎性反應［7］。在影響哮喘的細胞因子中，IFN-γ和IL-4是一對互為拮抗的細胞因子，IFN-γ能抑制IL-4mRNA轉錄，減輕EOS的浸潤，降低氣道炎性反應，同時還可以抑制免疫球蛋白的合成，對氣道起到保護作用，是Th1細胞分泌的拮抗哮喘發作的關鍵因子。IL-4則能誘導分泌促嗜酸性粒細胞聚集的細胞因子和促炎性反應因子，加重氣道炎性反應、氣道重塑和氣道高反應性，是Th2分泌的重要的促炎性細胞因子。IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2細胞的特征性細胞因子，所以常用IFN-γ／IL-4來反映Th1／Th2［8-11］。

本實驗研究發現，哮喘模型組大鼠BALF細胞涂片中EOS的數量較正常組顯著性增多，提示發生了EOS的大量浸潤，出現了嚴重的氣道炎性反應。給予激素和中、低劑量的小兒喘寶后，大鼠BALF細胞涂片中的EOS數量較模型組均出現顯著性減少，這說明激素和中、低劑量的小兒喘寶均有抑制氣道炎性反應的作用。通過對大鼠血清的IFN-γ和IL-4檢測中發現，哮喘大鼠的IFN-γ較正常大鼠顯著性降低，IL-4較正常大鼠顯著性升高，這表明Th2細胞優勢分化，Th2細胞分化相對弱勢，Th1／Th2的正常平衡被打破。但在給予哮喘大鼠中、低劑量的小兒喘寶之后，其血清中的IFN-γ含量比模型組大鼠有了顯著性的上升，且低劑量組比中劑量組上升更明顯；高、中、低劑量的小兒喘寶，均能明顯降低IL-4的含量，其中低劑量組下降最為顯著。對IFN-γ／IL-4進行計算發現，中、低劑量組的IFN-γ／IL-4比值均明顯高于模型組。另外，本實驗通過檢測了大鼠肺泡灌洗液（BALF）中的IFN-γ和IL-4含量，發現中、低劑量的小兒喘寶均能夠明顯升高哮喘大鼠BALF 中IFN-γ含量，并降低IL-4含量，中、低劑量組的IFN-γ／IL-4比值均明顯高于模型組。本實驗從大鼠整體（血清）和局部（肺泡灌洗液）的角度說明：中、低的劑量小兒喘寶可以有效的抑制Th2的活化，并促進Th1的生成，使不平衡的Th1／Th2回歸平衡狀態，從而起到減輕哮喘發作的效果。

支氣管哮喘病情頑固，遷延難愈，張仲景在《金匱要略》中記載“膈上病痰，滿喘咳吐，發則寒熱……必有伏飲”。明確提出，哮喘病反復發作的病機是“伏飲”，哮病的發病是因為宿痰伏肺，外邪引觸，痰氣交阻［12］。伏飲存在于哮喘的發作期和緩解期，化痰逐飲，消除宿痰是探尋治療哮喘的重要治療原則［13］。小兒素體陽盛，受外邪侵襲后容易從火化熱，且小兒常有消化不暢，食滯等癥狀，故臨床上以熱性哮喘較為常見［14］。肺主氣，司呼吸，肺是人體氣機升降的樞紐。氣機升降正常，則呼吸通暢，氣機逆亂，則喘息發作［15］。周耀庭教授創制的小兒喘寶集解表、清熱、理氣、祛痰于一方以去除頑邪，共奏宣肺平喘、清熱化痰及宣降氣機之功。

綜上所述：小兒喘寶能糾正哮喘大鼠血清及肺泡灌洗液中失衡的Th1／Th2。中、低劑量的小兒喘寶能顯著性減少哮喘大鼠BALF細胞涂片中的EOS數量，減輕炎性反應；同時可以升高哮喘大鼠血清和BALF中的IFN-γ，降低血清和BALF中的IL-4，從而升高IFN-γ／IL-4比值，逆轉失衡的Th1／Th2狀態。本實驗通過不同劑量的小兒喘寶干預哮喘大鼠模型實驗，證實了中、低劑量的小兒喘寶能夠有效的減輕哮喘的發作，調節血清和BALF中的Th1／Th2失衡，這可能是本方治療支氣管哮喘的作用機制之一，提示小兒喘寶在治療哮喘方面有良好的應用前景。

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（2015－09－15收稿 責任編輯：王明）

作者聲明

本刊2015年第12期第1957頁，《中醫高校教育信息化評估體系優化路徑的探討》一文第一作者項馨立單位更改為：1）南京中醫藥大學（攻讀研究生單位）；2）江蘇省第二師范學院（工作單位）。特此聲明！

中圖分類號：R285. 5

文獻標識碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 032

通信作者：李明（1963. 11—），女，大學本科，副教授，研究方向：方劑配伍規律及功效機制研究，E-mail：13611386113＠163. com

作者簡介：陳誠（1990. 06—），男，碩士研究生，研究方向：方劑配伍規律及功效機制研究，E-mail：chengchen5790＠163. com

基金項目：北京市教育委員會2014年首都中醫藥研究專項（編號：14ZY03）；北京中醫藥“薪火傳承3＋3工程”周耀庭名老中醫工作室項目；周耀庭全國名老中醫藥專家傳承工作室建設項目