兩種纖維素降解菌對粗飼料的混合發酵研究

李鵬飛 高懷峰

（榆陽區畜牧技術推廣站，陜西榆陽 719000）

兩種纖維素降解菌對粗飼料的混合發酵研究

李鵬飛 高懷峰

（榆陽區畜牧技術推廣站，陜西榆陽 719000）

本實驗以粗飼料為發酵對象，利用微生物發酵原理，通過PDA固體培養基平板拮抗實驗，得到兩種纖維素降解菌菌株—酵母菌和黑曲霉菌，采用PDA液體培養基擴大培養，并對不同配方的粗飼料同時進行分別接種和混合接種，在25℃下（設對照組）固體發酵。隨著原粗飼料中粗蛋白、粗纖維含量的下降，發酵飼料的粗蛋白、粗纖維變化量有上升趨勢。通過微生物發酵，提高了粗飼料的莒養成分，改善了粗飼料的適口性。

粗飼料；酵母菌；黑曲霉菌；混合發酵

1 研究內容

1.1實驗儀器、設備

分析天平、恒溫箱、樣品粉碎機、高壓滅菌鍋、冰箱、無菌接種箱、照相機、燒杯、試管、培養皿、溫度計、凱氏定氮儀、菌種培養機制備實驗儀器及飼料質量檢測的常規儀器和試劑等。

1.2實驗材料

1.2.1培養基

PDA固體培養基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%。

PDA液體培養基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，磷酸氫銨0.1%，硫酸鎂0.05%。

1.2.2固體發酵原料

玉米秸稈、統糠、麩皮、蔗糖、尿素、石粉、食鹽。

1.2.3菌種

實驗室保存的純種酵母菌和黑曲霉菌。

1.3實驗方法

1.3.1菌種的活化和制備

（1）菌種培養基的制備：PDA固體培養基（馬鈴薯瓊脂培養基），即稱取30g去皮馬鈴薯（未出芽），切成小塊，加水煮沸20分鐘，用4～6層紗布過濾，配置成20%馬鈴薯浸汁；加入2%葡萄糖，加熱煮沸后再加入2%瓊脂，繼續加熱溶化并補足失水定容150ml；分裝與6支試管和3個平板中（試管裝15ml，平板裝20ml），采用高壓滅菌鍋滅菌1h，取出后降試管擺放成斜面冷卻。

（2）接種：在無菌接種箱中采用化線法接種。每個處理作3個重復。注意在換菌種時，切記要將接種針在酒精燈火焰上灼燒，進行滅菌，且當其恢復適宜溫度時，接種下一種菌種于培養基上。

（3）菌種培養：在25±0.1℃下培養，待長滿菌絲后取出備用。

1.3.2菌種間拮抗試驗

（1）材料：上述PDA固體培養基平板和上述制備好的酵母菌和黑曲霉菌。

（2）接種：在無菌接種箱中采用點種法接種。作3個重復。注意在換菌種時，切記要將接種針在酒精燈火焰上灼燒，進行滅菌，且當其恢復適宜溫度時，接種下一種菌種于培養基上。

（3）倒置培養：在25±0.1℃下倒置培養3～5d，觀察、記錄、拍照。

1.3.3固體發酵實驗

（1）菌種的擴大培養：PDA液體培養基，即稱取所需去皮馬鈴薯（出芽的馬鈴薯不能用），切成小塊，加水煮沸20min，用4～6層紗布過濾，配置成20%馬鈴薯浸汁；加入2%的葡萄糖、0.2%的蛋白胨、0.1%的磷酸二氫鉀、0.05%的硫酸鎂，繼續加熱溶化并補足失水定容300ml；分裝入6個錐形瓶中；采用濕熱滅菌法滅菌1h，冷卻后在無菌接種箱中接種（2瓶接黑曲霉菌，四瓶接酵母菌），在27.5℃、1500r/min的搖床培養48h。

（2）培養基：按照固有配方做固體發酵培養基于玻璃瓶中（每瓶50g），每樣做三個重復，共需玻璃瓶份數：（酵母菌×3+黑曲霉菌×3+混合菌×3）×3種配方+3對照組=30份；（加水量為60%）。將玻璃瓶封口后采用濕熱滅菌法滅菌1h，待冷卻后接種。

（3）接種：在無菌接種箱接種，接種量為：酵母菌為20%；黑曲霉菌10%，接種方法為：先接種酵母菌10%，7d后再在接種酵母菌和黑曲霉菌各10%。然后在20℃左右培養25d后測其指標。

1.3.4實驗驗指標測定

（1）粗蛋白測定：半微量凱氏定氮法。（2）粗纖維的測定：GBT 6434-2006［26］。

（3）pH值測定：準確稱取10g飼料樣品，溶解于100ml蒸餾水中，沉淀15min，過濾，用精密pH試紙測定稀釋液的pH值。

2 實驗結果

2.1菌種的拮抗試驗

菌種拮抗試驗結果為：酵母菌與黑曲霉菌不發生拮抗，在開始培養前24h內酵母菌生長旺盛，黑曲霉菌用肉眼幾乎看不到菌絲，48h可見黑曲霉菌有少數菌絲出現，72h黑曲霉菌菌絲數量幾乎和酵母菌菌絲數量相當，此后黑曲霉菌迅速生長，菌絲數量遠遠超過酵母菌。總之，試驗的兩種菌種不發生拮抗，但由于黑曲霉菌后期生長能力強而發生營養競爭導致酵母菌生長較弱，因此，在作固體發酵時可將酵母菌與黑曲霉菌的接種比例定為2：1，先接種酵母菌10%，7d后再在接種酵母菌和黑曲霉菌各10%。

2.2固體發酵實驗

2.2.1發酵實驗前后粗飼料中粗蛋白的變化分析

通過對比分析可知，采用不同配方和不同方法發酵后，發酵粗飼料中的粗蛋白都有不同程度大上升，其中酵母菌發酵的變化較小，最高為62.32%，黑曲霉菌的最高變化為144.81%，兩種菌種混合后變化最大，最高達224.85%。

2.2.2發酵實驗前后粗飼料中粗纖維的變化分析

由實驗結果分析可知，采用不同配方和不同方法發酵后，發酵粗飼料中的粗纖維都有不同程度大下降，其中酵母菌發酵的變化較小，最高為-25.95%，黑曲霉菌的最高變化為-40.93%，兩種菌種混合后變化最大，最高達-50.52%。

3 結論

經微生物發酵后，粗飼料中的粗蛋白和粗纖維都有不同程度的變化。無論是采用單獨發酵還是混合發酵，發酵飼料中的粗蛋白含量極顯著提高，最高達到224.51%，發酵飼料中的粗纖維含量極顯著下降，最大下降率達50.33%。另外，采用混合菌發酵比各菌株單獨發酵效果極明顯；黑曲霉菌的發酵效果比酵母菌明顯。而且，隨著原粗飼料中粗蛋白、粗纖維含量的下降，發酵飼料的粗蛋白、粗纖維變化量有上升趨勢。

［1］吳文韜，鞠美庭，劉金鵬，等.一株纖維素降解菌的分離、鑒定及對玉米秸稈的降解特性［J］.微生物學通報，2013，40（4）：712-719.