機械通氣相關性肺損傷大鼠模型的建立與評價

任俊明　郭永清

[摘要] 目的 建立機械通氣相關性肺損傷大鼠模型并進行評價，確定建立機械通氣相關性肺損傷大鼠模型的最適通氣條件。 方法 選取成年雄性SD大鼠72只，體重250～300 g，隨機分為A、B、C、D組（n=18）：對照組（A 組，自主呼吸組），小潮氣量（VT）組（B組，VT=6 ml/kg），常規VT組（C組，VT=10 ml/kg），大VT組（D組，VT=40 ml/kg），各組按機械通氣時間（2、4、6 h）再隨機分為3個亞組（n=6）。A組僅作氣管切開插管，其余各組氣管切開后接小動物呼吸機行機械通氣，呼吸機參數均設置為RR 70/min，FiO2 21%，PEEP 0 cmH2O。機械通氣結束后處死大鼠，剖胸取右肺組織計算濕重干重比（W/D），計算細胞凋亡指數，HE染色后光鏡下觀察肺組織病理學結果，并進行肺損傷評分。比較不同VT及通氣時間條件下大鼠的肺損傷情況。 結果 與A、B、C組比較，D組通氣2 h時開始出現肺損傷病理學表現，通氣4 h時肺損傷評分、肺組織W/D和細胞凋亡指數均升高，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 給予大鼠40 ml/kg VT通氣4 h可以成功建立機械通氣相關性肺損傷模型。

[關鍵詞] 機械通氣相關性肺損傷；機械通氣；動物模型；大鼠

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）02（c）-0011-04

[Abstract] Objective To establish and evaluate the rat model of ventilator-induced lung injury，and to determine the best ventilation condition of rat model of ventilator-induced lung injury. Methods 72 adult male SD rat were selected，weight was 250-300 g，and they were randomly divided into group A，B，C and D （n=18）.Control group （group A，spontaneous breathing group），low tidal volume group （group B，VT=6 ml/kg），routine tidal volume group （group C，VT=10 ml/kg） and high tidal volume group （group D，VT=40 ml/kg）.Each group was divided into 3 subgroups （n=6） according to duration of mechanical ventilation （2 h，4 h and 6 h）.group A was only given tracheotomy tube，the others were given small animal breathing machine to conduct mechanical ventilation after tracheotomy.The parameter of breathing machine was set as RR 70/min，FiO2 was 21%，PEEP was 0 cmH2O.The rat were sacrificed after the end of mechanical ventilation，W/D of right lung tissue taken by splitting chest was counted and cell apoptosis index was counted.The pathology results of lung tissue were observed under light microscope after HE staining.The score of lung damage was valued.Lung damage of rat at different tidal volume and duration of ventilation was compared. Results Compared with group A，B and C，lung damage pathology feature appeared after 2 h ventilation in group D and all of the lung damage score，W/D of lung tissue and cell apoptosis index was increased respectively，and the difference was statistical significance （P<0.05）. Conclusion Rat is given 40 ml/kg of tidal volume and ventilation for 4 h can establish the model of ventilator-induced lung injury successfully.

[Key words] Ventilator-induced lung injury；Mechanical ventilation；Animal model；Rat

機械通氣（mechanical ventilation，MV）在危重患者的救治和麻醉維持過程中起重要作用，然而MV使用不當本身可以誘發嚴重肺損傷[1]。MV過程中較高的潮氣量（VT）可以損害肺泡-毛細血管黏膜屏障，破壞肺組織內皮細胞和上皮細胞增加其通透性[2]，同時機械刺激導致肺泡內炎癥細胞募集活化并釋放炎癥介質和細胞因子從而引起肺損傷[3]。目前，國內外肺損傷動物模型制備多選擇鼠類、兔類、犬類、綿羊等動物，其中鼠類具有經濟性、細胞生物學角色的可用性等優點使其在肺損傷模型建立研究中運用較多[4-5]。本研究主要比較不同VT及通氣時間條件下大鼠的肺損傷情況，確定建立MV所致肺損傷大鼠模型的最適通氣條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取健康的成年清潔級雄性SD大鼠72只，體重250～300 g，由北京海淀興旺動物養殖場提供。

1.2 儀器與試劑

HX-300動物呼吸機（成都，泰盟）；動物天平-YB102（中國，海康）；電熱鼓風干燥箱（上海，精宏）；細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；戊巴比妥（西安沃爾森生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物準備 用2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）溶液進行腹腔注射麻醉，待麻醉起效后給予稱重、固定架體位固定。頸部皮膚備皮、碘伏消毒，用手術刀沿氣管長軸切約1.0 cm皮膚切口，同時用止血鉗鈍性分離切口下皮膚組織和肌肉，暴露大鼠氣管。將自制14G氣管導管緩慢刺入氣管向前推進1.0 cm、拔出管芯，通氣確定在主氣管內手術縫線固定套管后接小動物呼吸機行MV，四肢連接生物機能監護儀持續進行心電圖監測。行尾靜脈穿刺保持靜脈通暢；整個過程中維持室溫26～28℃。實驗中按大鼠出血量和生理需要量維持輸液[1 ml/（kg·h）生理鹽水][6]。

1.3.2 動物分組 將大鼠隨機分為A、B、C、D組（n=18），予以不同VT和通氣時間。對照組（A 組，自主呼吸組），小VT組（B組，VT=6 ml/kg），常規VT組（C組，VT=10 ml/kg），大VT組（D組，VT=40 ml/kg），每組18只，各組分別按通氣時間（2、4、6 h）再隨機分為3個亞組，每個亞組各 6 只大鼠。A組僅作氣管切開插管，其余各組氣管切開后接小動物呼吸機行MV，B、C、D組呼吸機參數均設置為RR 70/min，FiO2 21%，PEEP 0 cmH2O。

1.4 檢測指標

實驗中觀察心電圖，通氣結束即刻處死動物。剖胸取右側肺組織計算濕重干重比（W/D），另一側肺做病理學及細胞學凋亡檢測。

1.4.1 血流動力學指標 連續觀察心電圖變化、心率。

1.4.2 肺組織 W/D 取大鼠右肺組織，先稱濕重，再放置于電熱鼓風干燥箱中，干燥箱溫度設定為80℃，恒溫烘烤直到肺組織至恒重后稱肺干重，然后計算肺組織 W/D。

1.4.3 肺組織病理學檢查 取部分左肺組織用4%多聚甲醛溶液固定，經過石蠟包埋、切片、HE染色等處理后，置于光學顯微鏡下觀察肺泡及毛細血管充血、肺內出血、中性粒細胞在血管壁及肺間隙浸潤、肺泡壁增厚或者透明膜形成以上四項進行肺損傷評分。采用3分制計分：無改變0分，輕度改變1分，中度改變2分，重度改變3分，然后累計總分。每個標本選取5個高倍視野，評分后取其均值。

1.4.4 TUNEL法檢測肺組織細胞凋亡程度 經過TUNEL染色的肺組織細胞若細胞核內出現棕黃色顆粒即為陽性結果，置于高倍鏡下（×400）隨機選取5個不重復視野，計數100個細胞中TUNEL陽性細胞數，計算細胞凋亡指數。

1.5 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，不同組別、組內不同時間點間比較采用方差分析，用Bartlett檢驗進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性則用LSD做兩兩比較，若不滿足方差齊性則采用Dunnet檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺的病理學改變

肉眼觀察可見，A、B組肺組織未見明顯的損傷改變，C組通氣6 h時可見肺組織出現中度充血、水腫，橫切面可見不規則淤血區。D組在通氣2 h后可見肺組織水腫充血明顯，通氣4 h后肺表面出現大量出血點，通氣6 h后出血點形成不規則片狀。經HE染色后光鏡下可見A、B組病理形態大致正常，C組通氣6 h出現肺內輕度出血、肺泡壁輕度增厚并有透明膜形成。D組2 h即可見肺內彌散存在出血點，通氣4 h時可見大量散在出血點，肺泡間隔增寬，肺泡腔滲液較多，通氣6 h肺組織結構完全破壞，肺泡發生融合，肺組織實變。C、D肺組織損傷程度隨通氣時間的增加而加劇（圖1）。

2.2 4組肺組織W/D、肺損傷評分及細胞凋亡指數的比較

與A組比較，C、D組肺組織 W/D、肺損傷評分及細胞凋亡指數隨著通氣時間的增加均明顯升高（P<0.05），B組上述各項指標差異無統計學意義（P>0.05）。C、D組內3個時間點肺組織 W/D、肺損傷評分及細胞凋亡指數值均隨時間的變化明顯升高（P<0.05），A組上述各項指標差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。

3 討論

危重患者在呼吸機的支持治療中常并發機械通氣相關性肺損傷（VILI）。目前，國內外研究認為，VILI的發生主要由于呼吸機參數設置不當，即較高氣道壓或容量導致吸氣末肺組織的過度擴張而呼氣末肺容積過低使不張的終末小氣道和肺泡隨機械通氣周期性地開放和關閉[7]，從而導致機械性肺損傷的發生。有的研究也發現，隨著通氣時間的增加，肺損傷的趨勢也越來越明顯[8]。臨床工作中主要是通過改變呼吸機通氣模式和通氣策略來避免VILI的發生，但是至今對于呼吸機通氣模式的設置沒有達成明確的共識，本研究通過動物肺損傷模型制備來尋找最適通氣模式。

目前，國內外研究中常見的機械通氣肺損傷動物模型制備方法有兩種：一是在壓力控制通氣模式下給予較高的吸氣壓力導致肺損傷的發生，2015年，Yang等[9]研究發現，給予大鼠吸氣壓力10 cmH2O，PEEP=0 cmH2O，RR 50/min，通氣4 h后可以復制大鼠肺損傷的發生。Dreyfuss等[10]的研究也證實，給予家兔45 cmH2O的吸氣壓力，MV過程中會很快出現肺損傷的表現。該方法的缺點是吸氣壓力大小的設置不好確定，沒有明確的文獻支持，沒有找出導致肺損傷發生的最佳吸氣壓力值[11-12]，此類方法在實驗研究中運用較少。二是容量控制通氣模式下給予大VT的MV，隨著時間的增加肺損傷程度逐漸加重。Huang等[13]的研究發現，當VT設定為30 ml/kg，RR 25/min，FiO2=21%，通氣2 h即可出現肺損傷，這說明VT和通氣時間是導致肺損傷發生的關鍵因素[14-16]。

本研究中比較了不同VT（6、10、40 ml/kg）和不同通氣時間（2、4、6 h）條件下肺損傷的發生程度，同時通過肺損傷評分、細胞凋亡指數、光鏡下病理結果來評價VILI模型建立的成功與否。結果發現，給予VT 40 ml/kg通氣2 h時光鏡下可見大鼠肺內點狀出血點，肺泡腔內滲出液增多。通氣4 h后可見肺內大量散在出血點，肺泡間隔增寬肺泡膜增厚，肺泡腔內大量滲出液，部分肺泡破裂融合。通氣6 h后肺組織結構完全破壞。同時隨著VT的增大和通氣時間的增加，肺損傷評分及細胞凋亡指數在增高也說明了肺損傷程度的加重。相比之下，VT=6 ml/kg通氣組大鼠肺組織沒有出現肺泡水腫、炎癥滲出等急性肺損傷表現。VT=10 ml/kg通氣組大鼠在通氣6 h后可見有輕度肺內出血點、肺泡壁輕度增厚表現。綜上所述可以得出結論：VT=40 ml/kg通氣2 h即可導致肺損傷，通氣4 h可穩定建立大鼠MV所致肺損傷大鼠模型。

本研究中給予大鼠小VT（VT=6 ml/kg）通氣大鼠可以存活數小時甚至數天，小潮氣量對大鼠肺部的損傷是極其緩慢的。相比之下，給予大VT（VT=40 ml/kg）通氣的大鼠肺損傷發展較快數小時內即可出現典型的肺損傷表現，因此建立大鼠VILI模型需要給予合適的VT和通氣時間，本實驗成功建立了大鼠VILI模型，為今后從事相關肺損傷的研究提供了動物學模型的參考依據。

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（收稿日期：2015-11-11 本文編輯：許俊琴）