加減駐景方含藥血清對CoCl2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞表達(dá)VEGF及HIF-1α的影響

高 娜，亢澤峰，褚文麗，陶方方

·論著：實(shí)驗(yàn)研究·

加減駐景方含藥血清對CoCl2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞表達(dá)VEGF及HIF-1α的影響

高 娜1，亢澤峰2，褚文麗2，陶方方2

目的探討加減駐景方含藥血清對二氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)后人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（ARPE-19細(xì)胞系）中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）蛋白表達(dá)的影響。方法1.體外培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，取對數(shù)生長良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，分為正常組，缺氧模型組，陽性對照組、含藥血清組，并設(shè)立不同時(shí)間點(diǎn)。2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）觀察CoCl2誘導(dǎo)后不同時(shí)間、各組細(xì)胞上清液中HIF-1α的表達(dá)。3.蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）觀察CoCl2誘導(dǎo)后不同時(shí)間、各組細(xì)胞中VEGF、HIF-1α的表達(dá)情況。結(jié)果缺氧損傷后可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞中VEGF、HIF-1α蛋白的表達(dá)增加；與正常組比較，缺氧模型組VEGF及HIF-1α的表達(dá)高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；含藥血清組與模型組比較，VEGF及HIF-1α的表達(dá)低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論加減駐景方含藥血清對缺氧損傷后ARPE-19細(xì)胞中VEGF、HIF-1α蛋白的表達(dá)有抑制作用。

加減駐景方；視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子；低氧誘導(dǎo)因子

研究表明脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）的發(fā)生中，由于炎癥及缺氧致局部微環(huán)境的改變，導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）增加，促進(jìn)了CNV的發(fā)生[1]。其中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α）相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是脈絡(luò)膜新生血管形成過程中的重要通路之一，是調(diào)控VEGF高表達(dá)的主要信號通路。我們在前期臨床觀察及動物實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，中藥加減駐景方能促進(jìn)黃斑出血的吸收，提高視力，改善視功能，并能抑制CNV的產(chǎn)生[2-4]。在進(jìn)一步對ARPE-19細(xì)胞缺氧模型的研究中發(fā)現(xiàn)，加減駐景方含藥血清能抑制ARPE-19細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步探討加減駐景方含藥血清是如何調(diào)控VEGF的表達(dá)及抑制CNV形成的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了加減駐景方含藥血清對CoCl2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞表達(dá)VEGF及HIF-1α蛋白的影響，為臨床中醫(yī)治療CNV提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞

正常健康SD大鼠20只[北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001]，體質(zhì)量150～170 g，雄性。在動物房適應(yīng)生活1周后開始實(shí)驗(yàn)。所有動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心屏障級動物房內(nèi)，恒溫恒濕，普通飲食及飲水喂養(yǎng)，循環(huán)光照（光照12 h，黑暗12 h），SPF飼養(yǎng)條件，溫度（22±2）℃。ARPE-19細(xì)胞（購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，批號：ATCCRCRL-2302TM）。

1.2 主要藥品、試劑及儀器

加減駐景方由楮實(shí)子、枸杞子、菟絲子、三七粉等組成（中藥飲片由北京燕北藥材公司提供，中藥水煎液由中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院煎藥室制備）。康柏西普眼用注射液（成都康弘生物科技有限公司，批號：S20130012，10 mg/ml，0.2 ml/支）。

MEM培養(yǎng)液（Hyclon公司）；胎牛血清（GIBCO公司）；二氯化鈷（北京化工公司）；人血管內(nèi)皮生長因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；HIF-1α ELISA試劑盒（cloudclone corp）；蛋白定量（BCA法）試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；抗HIF-1α抗體AB5382-100 μg（Millipore）；抗VEGF抗體ABS82-100 μg（Millipore）；RIPA裂解緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；蛋白酶抑制劑混合物（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；電泳緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；轉(zhuǎn)膜緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

主要儀器設(shè)備：5%二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo electron corporation）；熒光倒置顯微鏡（Olympus，IX81）；4℃離心機(jī)（Germany）；電泳儀（BIO-RAD，USA）；紫外分光光度計(jì)（BIO-RAD，USA）；GE-ImageQuant-LAS-4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀（GE Healthcare）。

1.3 含藥血清的制備方法

正常健康SD大鼠20只，按奇偶數(shù)隨機(jī)分成加減駐景方含藥血清組和空白血清組，每組10只。含藥血清組給予加減駐景方灌胃，灌胃體積均為20 ml/kg，每日2次，連續(xù)給藥3 d。空白血清組給予等量的蒸餾水溶液。末次給藥1 h后腹腔注射鹽酸氯胺酮35 mg/kg與鹽酸賽拉嗪5 mg/kg的混合液麻醉，無菌條件下腹主動脈采血，常溫靜置、離心、取上清液、滅菌、過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中HIF-1α蛋白

按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，取對數(shù)生長期良好的8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。分為正常組，缺氧模型組（100 μmol/L，CoCl2），康柏西普陽性對照組（20 μg/ml康柏西普）、加減駐景方含藥血清組（20%）。37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的MEM繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再次棄培養(yǎng)液，根據(jù)分組不同，正常組加不含胎牛血清的MEM，其他各組分別加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度、時(shí)間段各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液于離心管內(nèi)，樣品檢測前存儲于-80℃?zhèn)溆谩０凑杖薍IF-1α ELISA檢測試劑盒說明進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot法檢測細(xì)胞中VEGF及HIF-1α蛋白

細(xì)胞的培養(yǎng)、分組、干預(yù)方法同上述實(shí)驗(yàn)，采用細(xì)胞裂解提取細(xì)胞總蛋白，按BCA法測樣本蛋白質(zhì)濃度，按照Western blot實(shí)驗(yàn)步驟，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算VEGF及HIF-1α蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用重復(fù)測量資料的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法檢測HIF-1α蛋白的表達(dá)情況

各組ARPE-19細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞上清液中的HIF-1α含量的總體差異不同（重復(fù)測量資料的方差分析，F(xiàn)分組=147.839，P＜0.001；F時(shí)間=895.702，P＜0.001；F交互作用=3.215，P＜0.05），缺氧組HIF-1α水平明顯高于正常組（P＜0.001），含藥血清組、康柏西普陽性對照組的HIF-1α數(shù)值與正常組較為接近（P＞0.05）（表1，圖1）。

表1 ELISA法檢測各組ARPE-19細(xì)胞上清液中HIF-1α的含量（x±s）

圖1 各組ARPE-19細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞上清液中HIF-1α含量的變化情況HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子-1α

2.2 Western blot檢測VEGF及HIF-1α蛋白的表達(dá)情況

各組ARPE-19細(xì)胞中VEGF表達(dá)的變化趨勢比較接近（隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸增高），且不同組間以及不同時(shí)點(diǎn)之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（重復(fù)測量資料的方差分析，F(xiàn)分組=18.261，P＜0.01；F時(shí)間= 113.018，P＜0.001；F交互作用=0.615，P=0.715）。模型組細(xì)胞中的VEGF含量高于其他三組（P＜0.001），而正常組、康柏西普組及含藥血清組細(xì)胞中的VEGF水平整體上差異不大（表2，圖2～圖3）。

表2 Western blot法檢測各組ARPE-19細(xì)胞中VEGF的相對表達(dá)量（x±s）

圖2 Western blot法檢測各組ARPE-19細(xì)胞中VEGF表達(dá)的電泳圖。1～3、4～6、7～9、10～12分別為正常組、缺氧模型組、康柏西普陽性對照組、加減駐景方含藥血清組在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)的結(jié)果VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

圖3 Western blot法檢測各組ARPE-19細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間VEGF相對表達(dá)量（VEGF/β-actin）的變化情況VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

各組不同時(shí)間細(xì)胞中HIF-1α的變化情況與VEGF的變化相似，組間以及各時(shí)點(diǎn)間的總體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（重復(fù)測量資料的方差分析，F(xiàn)分組= 54.186，P＜0.001；F時(shí)間=355.808，P＜0.001；F交互作用= 1.210，P=0.355）。與VEGF類似，模型組細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)水平明顯高于其他三組（P＜0.001），而其他三組的HIF-1α水平十分接近（表3，圖4～圖5）。

表3 Western blot法檢測各組ARPE-19細(xì)胞中HIF-1α的相對表達(dá)量（x±s）

圖4 Western blot法檢測各組ARPE-19細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的電泳圖。1～3、4～6、7～9、10～12分別為正常組、缺氧模型組、康柏西普陽性對照組、加減駐景方含藥血清組在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)的結(jié)果HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子-1α

圖5 Western blot法檢測各組ARPE-19細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間HIF-1α相對表達(dá)量（HIF-1α/β-actin）的變化情況HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子-1α

3 討論

研究表明，人類疾病和動物模型的CNV細(xì)胞成分主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞、RPE和炎癥細(xì)胞等組成，在CNV形成的不同階段，RPE起著不同的作用。在新生血管形成的起始期和活動期缺血缺氧、氧化應(yīng)激、衰老等因素可誘發(fā)RPE細(xì)胞分泌多種促血管生成因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、遷移，導(dǎo)致CNV的形成；在退化期，RPE基底膜增厚，分泌的促血管生成因子下調(diào)，血管生成抑制因子上調(diào)，促使CNV退化。可見RPE細(xì)胞在CNV發(fā)生過程中起著雙重調(diào)節(jié)作用。體外研究目前廣泛采用細(xì)胞或組織培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)簡化了環(huán)境條件，排除了一些復(fù)雜因素的影響，具有簡化性、針對性強(qiáng)等特點(diǎn)，其中的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19是此類研究比較常用的細(xì)胞模型[5-6]。因此本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，采用二氯化鈷模擬細(xì)胞缺氧，觀察各處理因素對ARPE-19缺氧后細(xì)胞增殖活性的影響。康柏西普眼用注射液作為抗VEGF藥物于2013年底在我國批準(zhǔn)上市，用于治療濕性年齡相關(guān)性黃斑病變[7]，該藥是一種VEGF受體與人免疫球蛋白Fc段重組的融合蛋白，能特異性地結(jié)合VEGF，通過抑制VEGF及其受體的信號傳遞達(dá)到對新生血管的抑制，從而達(dá)到治療相關(guān)新生血管性眼病[8-9]，因此選擇以康柏西普為陽性對照組。

體外實(shí)驗(yàn)中血清藥理的研究方法是重要環(huán)節(jié)，中藥含藥血清有著自身眾多的優(yōu)勢，在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞所處的內(nèi)環(huán)境與血清的理化性質(zhì)基本相同，這很好地排除了制劑本身對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。中藥含藥血清在方法學(xué)上為中藥及中藥復(fù)方的研究提供了新的途徑，排除了中藥制劑的理化干擾，為藥動學(xué)、藥化學(xué)、中藥及中藥復(fù)方藥理學(xué)提供了新的研究思路[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法和Western blot方法分別檢測了加減駐景方對低氧誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞上清液HIF-1α蛋白，以及ARPE-19細(xì)胞中VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組（100 μmol/L氯化鈷）中VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)顯著高于正常組，藥物干預(yù)組（20%的加減駐景方含藥血清組、20 μg/mL康柏西普陽性對照組）中VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)則顯著低于模型組，說明20%的加減駐景方含藥血清、20 μg/mL康柏西普均對VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)有抑制作用。在Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)VEGF和HIF-1α水平的結(jié)果中,我們未能觀察到組別因素對各指標(biāo)隨時(shí)間變化趨勢的影響,考慮可能與樣本量過小，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等因素有關(guān)，我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究細(xì)胞增殖與時(shí)間和藥物的具體關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)是從缺血模型著手進(jìn)行的中醫(yī)藥研究，下一步將試對加減駐景方治療CNV的多靶點(diǎn)多通路作用機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床用藥提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Korff T，Dandekar G，Pfaff D，et al.Endothelial ephrinB2 is controlled by microenvironmental determinants and associates contextdependently with CD31[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26（3）：468-474.

[2]張慶，田楠楠，亢澤峰，等.加減駐景方對實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的作用研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2013，23（2）：79-82.

[3]田楠楠，張慶，亢澤峰，等.駐景方對病理性近視脈絡(luò)膜新生血管VEGF表達(dá)的影響[J].國際眼科雜志，2013，13（8）：1525-1528.

[4]劉彥江，張?jiān)拢簼煞澹?加減駐景方聯(lián)合雷珠單抗治療高度近視性黃斑出血[J].國際眼科雜志，2014，14（2）：313-316.

[5]沈惠風(fēng)，李祎群，金若敏，等.中藥外敷治療哮喘的血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2007，5（1）：70.

[6]韓儉，于紅娟，吳勇杰，等.中藥血清藥理學(xué)方法學(xué)研究——抗菌試驗(yàn)含藥血清處理方案的研究[J].中藥藥理與臨床，2002，18（1）：47.

[7]周明眉，楊奎，姜遠(yuǎn)平，等.中藥血清藥理學(xué)的方法學(xué)研究——含藥血清低溫保存和血清滅活的影響[J].中藥藥理與臨床，1999，15（2）：44.

[8]Zhou M M，Yang K，Jing Y P，et al.Study on the methods of Chinese herbs，serum pharmacology：the effects of drug serum keep in low temperature and inactivation[J].Phar-macol Chin Mater Med，1999，15（2）：44-46.

[9]劉黎青，馬月香，秦厲梅，等.血府逐瘀湯含藥血清體外誘導(dǎo)MSC分化為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥信息，2013，30（5）：45.

[10]靳福鵬，張梅，李平，等.益氣養(yǎng)陰解毒方含藥血清對Lewis肺癌細(xì)胞增殖及凋亡影響的體外實(shí)驗(yàn)[J].腫瘤防治研究，2011，38（8）：866-870.

Effects of serum with modified Zhujing prescription on expression of VEGF and HIF-1α in cobalt chloride induced ARPE-19 cells

GAO Na,KANG Zefeng,CHU Wenli,et al.
The Second People's Hospital of Xining,Xining 810003,China

OBJECTIVE To explore effects of serum with modified Zhujing prescription on expression of vascular endothelium growth factor(VEGF)and hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α)protein in cobalt chloride induced ARPE-19 cells.METHODS 1.The ARPE-19 cells cultured in vitro and cells in well logarithmic growth were chosen to be assigned randomly into normal group,hypoxia group，positive control groups and medicated serum group.Time interventions were set for observation.2.Effects on expression of HIF-1α in supernate at different time point were assessed by ELISA.3.The expression of VEGF and HIF-1α protein in ARPE-19 cell under hypoxia were detected by Western Blot.RESULTS Expression of VEGF and HIF-1α increased after hypoxic injury,in addition, they were higher than counterparts of normal group.The difference was statistically significant(P<0.05).While compared with model group,expression of VEGF and HIF-1α in medicated serum group were higher statistically(P< 0.05).CONCLUSIONS Medicated serum with modified Zhujing prescription inhibited the expression of VEGF and HIF-1α in ARPE-19 cells under hypoxia injury.

modified Zhujing prescription;retinal pigment epithelium(RPE)cell;vascular endothelium growth factor(VEGF);hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α)

R285.5

A

1002-4379（2016）06-0351-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.06.001

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81574032）

1.青海省西寧市第二人民醫(yī)院眼科，西寧810003 2.中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京100040

亢澤峰，E-mail：zefeng2531@163.com