DNA條形碼的研究現狀概述

姚鵬程

(華東師范大學生命科學學院 上海 200241) 安 梅 (上海市南洋模范中學 200032)

隨著人類對于生物多樣性認識的不斷加深，生物多樣性的保護和持續利用成為世界性的重大需求，快速的物種鑒定也就越來越成為迫切的現實需要。但是，由于傳統分類學本身存在的固有局限以及傳統分類學工作者人數的不足，經典的物種鑒定渠道嚴重制約著生物多樣性的有效保護和合理利用，DNA條形碼技術隨即應運而生[1]。該技術是利用標準的、具有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段在物種內的特異性和種間的多樣性而創建的一種新的生物身份的識別系統，用以實現對物種的快速自動鑒定[1]。簡單地說，DNA條形碼技術的關鍵就是對一個或一些相關基因進行大范圍的掃描，進而鑒定某個未知的物種或者發現新種[2]。該技術一經提出就受到各國分類學家重視，迄今經過13年的研究，DNA條形碼已經得到了極大的發展，即已經從最初的篩選片段和獲得片段信息發展到在多個學科領域的廣泛應用。不過，隨著研究的不斷深入，利用現有DNA條形碼進行特定物種鑒定的局限性也逐漸顯現。

1 DNA條形碼的研究現狀

1.1 動物DNA條形碼的研究現狀 Hebert等[1]選取線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(COI)的一段序列在動物界門、目、種等不同分類水平上進行分析，發現無論在哪個分類水平上該基因都具有良好的識別能力，從而提議其中約650bp長的一段序列作為動物的標準DNA條形碼。此提議出來后，便不斷有研究對其適用性進行驗證。研究表明，所提議的片段可在物種水平上對絕大多數動物類群進行鑒定, 還能較準確地區分近緣類群。但是，由于動物界物種豐富度極高，截止2014年僅已知種類估計就有200萬種，其中大量物種的DNA條形碼數據尚未報道，目前對于動物DNA條形碼的研究依然集中于標準條形碼COI的物種片段數據的收集和分析。

1.2 植物DNA條形碼的研究現狀 相較于動物，植物線粒體基因組本身的一系列特點，使得以其作為植物的DNA條形碼并不具備明顯的優勢。植物線粒體基因組的相關特點主要包括：①基因組較大；②不同類群間因重復、插入或缺失現象等造成序列長度變異很大(300～2000kb)；③存在大量短而分散的重復序列(50～1000bp)；④重復序列引起的基因重組和基因突變會產生變異[3]；⑤基因組豐度較低，其提取和純化相對困難等。因此，人們把目光投向具有單親遺傳特性、分子量小且極少發生重組的葉綠體基因組，使之成為植物DNA條形碼研究的首選。研究者對各種候選片段進行了篩選, 涉及的片段主要分布在葉綠體基因的編碼區(rbcL、matK、trnL、accD、rpoC1、rpoB和ndhJ 等) 和間隔區(trnH-psbA、trnK-rps16、rpl36-rps8、atpB-rbcL、ycf6-psbM、trnV-atpE、trnC-ycf6、psbM-trnD、trnL-F、psbK-psbI和atpF-atpH等)[4]。至2009年，國際生命條形碼聯盟植物工作組已確定將rbcL 和matK作為植物的核心條形碼，此后，由于葉綠體基因間隔區trnH-psbA以及核基因ITS也具有相對較好的物種分辨率，又將這2個片段作為植物的補充條形碼。但在一些研究中發現，這四個條形碼片段仍不能解決物種鑒別問題.例如,楊培等[5]用這4個候選片段對黃精屬(Polygonatum)藥用植物進行DNA條形碼評價，得出的結論是4個推薦的條形碼片段單獨或者聯合均不適合黃精屬藥用植物的物種區分，因而提出重新篩選新片段的建議。國內外學者還將目光投向超級條形碼(super barcoding，即以葉綠體全基因組作為DNA條形碼)以及微型條形碼(mini barcoding，即比標準條形碼更短的DNA片段用于區分物種的序列)，以期解決疑難類群的物種區分問題。

1.3 微生物DNA條形碼的研究現狀 由于微生物形態結構簡單，形態特征受外界環境影響很大，導致微生物的形態鑒定存在很大的困難。真菌在人們生產生活中應用范圍廣，經濟價值高，因此國內外學者對于微生物的DNA條形碼研究側重于真菌。目前研究者主要是將真菌的DNA條形碼研究聚焦在線粒體基因COI和核基因ITS上。DNA條形碼技術應用于微生物分類研究，已發現了大量的隱種甚至隱屬。例如，Seifert等[6]對青霉屬(Penicillium) 的58個物種的370余份樣本的COI序列進行分析，發現青霉屬可能包含4個屬；Nguyen等[7]利用COI 序列發現錘舌菌屬(Leohumicola) 的3個新種。科學家估計全球約有150萬種真菌，而目前被發現命名的還只有大約10萬種，因此今后相當長的一段時間內，真菌DNA條形碼的研究將一直致力于新種新屬，甚至更高分類等級的發現和記錄。

1.4 DNA條形碼的應用現狀 DNA條形碼技術的主要應用目標是快速準確地識別和鑒定物種，這里不再贅述。除此以外，該技術在生態學、進化生物學、系統發育學，區系學，生物多樣性保護等學科中的應用也相當廣泛。裴男才[8]探討了DNA條形碼在進化生態學中的作用，認為DNA條形碼可量化動物取食特征和種子傳播交互網絡，用以評估每種食果動物對不同小生境中種子雨的貢獻。González-Varo等[9]利用DNA條形碼檢測到不同食果動物選擇性地取食不同果實或種子類型, 從而在植食性特征和種子凋落格局之間探討動植物協同進化特征。葛學軍[10]認為通過DNA條形碼的數據積累, 能夠構建高精度宏系統發育樹，開展精細尺度的植物系統發育區系學研究。向小果等[11]提出在系統發育學中可以用被子植物種系發生學組Ⅲ(APG III)作為系統發育骨架, 然后利用DNA條形碼片段進行系統發育分析，從而開展生物地理格局、群落系統多樣性等方面的研究。周世良等[12]認為DNA條形碼技術在保護生物學中可用于確定珍稀瀕危物種與其他生物的關系。另外，利用DNA條形碼技術可以確定哪些動物是花粉和種子的有效散布者[9]。

2 DNA條形碼的局限性

2.1 物種本身遺傳、分化特性造成的局限性 當種內DNA序列變異速率遠小于種間變異速率時，種內個體間遺傳差異與種間遺傳差異就能顯著區分，從而形成遺傳差異鴻溝(DNA barcoding gap)，這是鑒定兩個不同物種的理論依據。如果種內個體間遺傳差異與種間遺傳差異之間不存在這個鴻溝，表明相關物種間界限不明顯，通過DNA條形碼進行鑒定就無能為力。對于植物而言，由于其多倍化、雜交和輻射進化等多種因素的影響, 利用現有的DNA條形碼常常表現為遺傳差異鴻溝不明顯甚至不存在，因而不能對物種進行精確的鑒定。動物物種界限相對清晰，并具有特有的標準條形碼(COI)，但是不同種系間線粒體基因水平轉移以及近緣物種共享線粒體多態性現象加大了物種的鑒定難度，一定時期的環境變化導致DNA 序列突變加快也會影響鑒定結果[13]。對于真菌而言，種屬差異很大、總數龐大、基因序列的變異度大、很多通用的DNA條形碼序列被多個內含子干擾給鑒定工作帶來了更多不確定的因素。此外，條形碼需要首先對憑證標本進行鑒定，由于真菌形態上難于鑒定，目前每個屬種都是用部分具有代表性的菌株進行相關鑒定，致使DNA條形碼在此方面的鑒定中也會出現無能為力的狀態。

2.2 形態學種與分子鑒定結果不一致 由于形態性狀的平行進化或者趨同進化以及隱種的存在等原因，依據形態學特征確定的物種與依據DNA條形碼鑒定的結果之間有時會相互矛盾。一部分形態特征相似的直翅目昆蟲其系統發育分析結果與形態學研究結果不一致；溫帶卵胎生的海水魚條平鲉(Sebastestrivittatus)的形態分類與系統發育位置不一致；形態學方法鑒定貝類與利用核基因片段ITS進行分類鑒定的結果也存在差異。植物界這種不一致也不少，例如榕屬(Ficus)[14]、婆婆納屬(Veronica)[15]等。這些現象提示人們，當前乃至今后相當長時期內，期望DNA條形碼鑒定取代經典分類學工作是不現實的。

2.3 新一代DNA條形碼有待開發 DNA條形碼經過十幾年的發展已廣泛應用于物種鑒定，而在生產實踐中人們更期望將其用于對品種進行鑒定；對于珍稀物種保護，人們往往需要了解種群甚至某個個體的準確來源。對于這類問題，目前的DNA條形碼基本上無能為力。此外，DNA條形碼在實際應用中還會碰到“非標準材料”或樣品碎片，如中藥材、木制家具、茶葉、卷煙、動物消化殘渣，腐敗的動物組織等，這些材料內的DNA高度降解，常常并不能夠得到完整條形碼片段序列，因此存在不能利用現有條形碼進行鑒定的情況，需要運用新的技術手段加以解決。