鎘誘導錦鯉腎臟氧化性DNA損傷及谷胱甘肽抗氧化系統改變

劉思思++高旋旋++胡竹青++程超++渠漫漫++孫晴++劉纏民+++鄭桂紅

摘要：研究鎘（Cd）暴露對錦鯉（Carassius auratus L.）腎臟氧化應激、氧化性DNA損傷、谷胱甘肽抗氧化系統的影響。試驗采用靜水生物養殖法，將40尾錦鯉隨機分為4組，每組10尾，分別暴露于0、5、10、20 mg/L的CdCl2水溶液中，持續96 h。觀察錦鯉的行為變化，測定腎臟丙二醛（MDA）含量、氧化性DNA指標8-羥基鳥嘌呤（8-OHdG）水平、還原型谷胱甘肽（GSH）水平，并檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）的活性。結果表明，Cd暴露使錦鯉發生明顯改變，MDA、8-OHdG、GSH水平均升高，并改變了谷胱甘肽抗氧化酶系統。

關鍵詞：錦鯉；鎘；腎臟；DNA損傷；氧化應激

中圖分類號： S941.91文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0272-02

收稿日期：2015-06-08

基金項目：江蘇省自然科學基金（編號：BK20141147）；江蘇省徐州市科技計劃（編號：XF11C051）；江蘇省化學生物學優勢學科基金（編號：PAPD）。

作者簡介：劉思思（1988—），女，江蘇徐州人，碩士研究生，主要從事生態學研究。E-mail：liusisi644@163.com。鎘（Cd）是一種毒性很大的重金屬，主要作為鋅礦、硫化物礦、鉛礦、銅礦等的副產物，在礦的開采、冶煉、精煉過程中進入環境，并對環境造成危害。鎘一旦進入水中，會對水體生態系統造成嚴重污染，危害水生生物的生命[1-2]。

錦鯉（Carassius auratus L.）是鯉科（Cyprinidae）鯉屬（Carassius）的一種觀賞魚，顏色艷麗，形態優美，同時也是水生環境監測的一種試驗魚種類[3]。氧化應激是重金屬對魚類造成損傷的常見方式，很多重金屬都會誘導氧化應激損傷[2-3]。谷胱甘肽抗氧化酶系統由還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）組成，在動物機體抗氧化損傷中承擔重要作用[4]。研究表明，鎘能夠引起淡水鲇魚（Channa punctatus）[2]、廣東魴（Megalobrama terminalis）[5]、草魚（Ctenopharyngodon idellus）[6]等魚的氧化損傷。本研究以錦鯉為試驗對象，探討鎘暴露對錦鯉腎臟DNA損傷、谷胱甘肽抗氧化系統的影響，以期為環境監測及鎘害防治提供依據。

1材料與方法

1.1材料

供試紅白錦鯉購自徐州市佳順錦鯉養殖基地，體長5～7 cm、質量4～7 g/尾。試驗采用靜水生物養殖法。試驗用水為曝氣3 d的自來水，每組20 L，24 h不間斷充氧，溶氧量 6 mg/L，pH值6.8，水溫（23±1） ℃。先將錦鯉置于室內水族箱進行為期7 d的預試驗。錦鯉暫養期間活動正常、無病，死亡率低于5%。于試驗前24 h停止飼喂，選擇品相較好、健康的紅錦鯉40尾，隨機分為4組，3個處理組的CdCl2濃度分別為5、10、20 mg/L。試驗期間不飼喂、 不換水，每天觀察其行為。于96 h后處死，取其腎臟，冰浴生理鹽水勻漿，以 3 000 r/min 冷凍離心10 min制備組織上清液，測定其生化指標。

1.2 魚行為觀察

按照Sveceviius的方法[7]將魚的行為活性分為5級（0、1、2、3、4級）。每天觀察記錄魚的行為并對其分級。

1.3氧化應激及谷胱甘肽抗氧化系統指標測定

丙二醛（MDA）水平、還原型谷胱甘肽（GSH）水平、蛋白含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）活性、谷胱甘肽還原酶（GR）活性均采用試劑盒（南京市建成生物工程研究所）進行測定，谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）采用蘇州市科名生化指標試劑盒測定，所用儀器為UV-722型紫外可見分光光度計。

1.4DNA損傷測定

根據已有研究的方法[8]，采用商品試劑盒（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.），按說明書進行操作。采用帶有檢測器的高效液相色譜（Agilent Technologies，USA）進行測定，8-OHdG 的表示方法為8-OHdG/10-5 deoxyguanosine。

2 結果與分析

2.1鎘對魚行為的影響

觀察魚的行為并測定其行為活性。由圖1可知，不同濃度鎘暴露對魚的行為具有不同影響。與對照組相比，中低濃度鎘暴露抑制魚的行為活性，而高濃度鎘暴露則呈1 d時抑制、之后強烈激發的現象。以不同時間比較，各處理組均呈 1 d 行為活性不高、2～3 d活性增強、4 d活性下降的趨勢，但仍高于對照組。

2.2鎘對魚腎臟的氧化應激及DNA損傷

MDA含量、8-OHdG水平常作為氧化應激的指標，由測定結果（表1）可知，鎘暴露導致錦鯉腎臟MDA含量、8-OHdG水平明顯升高。與對照組相比，5、10、20 mg/L鎘暴露下MDA含量分別增大15.2%、169.4%、398.0%，8-OHdG水平分別增大16.1%、32.3%、64.5%。可見，鎘暴露引起了錦鯉腎臟氧化應激損傷及DNA損傷。

2.3鎘對錦鯉腎臟谷胱甘肽抗氧化系統的影響

由錦鯉腎臟谷胱甘肽抗氧化系統指標的測定結果（表2）可知，96 h鎘暴露使系統活性明顯升高。與對照組相比，5、10、20 mg/L鎘暴露下GSH含量分別增加8.7%、20.2%、27.0%，GPX活性分別提高10.4%、15.7%、24.2%，GST活性分別提高16.3%、33.1%、57.8%，GR活性分別提高 16.0%、30.3%、46.3%，GCL活性分別提高18.1%、28.2%、32.7%?？梢姡k暴露導致錦鯉腎臟谷胱甘肽抗氧化系統發生改變。

3結論與討論

鎘會對水生生態系統造成很大影響。本研究表明，不同體積分數的鎘暴露對錦鯉行為活性具有不同影響，呈低抑制、高激發的現象。在5、10 mg/L的鎘暴露濃度下，行為活性均明顯低于對照；20 mg/L的鎘暴露濃度則明顯激發行為活性，表明高濃度鎘暴露對錦鯉具有明顯刺激作用。行為活性隨時間的推移呈早期激發、后期抑制的趨勢，表明錦鯉剛接觸鎘刺激時活性變強，疲憊后活動行為變慢。

脂質過氧化產物指機體中脂質被氧化后的產物，是反映氧化應激的重要指標。研究表明，鎘能夠強烈抑制線粒體電子傳遞鏈，導致電子無法正常傳遞至接受體，而是傳遞至氧原子，從而產生大量氧自由基，引起機體氧化損傷[2-9]。氧自由基也可通過多種途徑造成DNA損傷，如引起單鏈DNA斷裂、DNA與蛋白質交聯、構成DNA的基礎物質發生改變。8-OHdG是氧自由基誘導鳥嘌呤C-8發生羥基改變的產物，因此8-OHdG常作為氧化性DNA損傷的標志[4]。本試驗中，脂質過氧化產物MDA含量、8-OhdG水平均明顯升高，表明鎘暴露引起了錦鯉腎臟氧化損傷。

谷胱甘肽是一種非酶抗氧化物質，在調節脂質過氧化產物的產生、減少氧化反應發生中起重要作用。已有研究表明，鎘暴露能夠誘導GSH含量的升高，可能是由于對抗其引起的氧化應激損傷[10]。本試驗發現96 h鎘暴露同樣引起了GSH含量的升高。GR、GCL是維持GSH含量的重要酶，GR能夠催化氧化型谷胱甘肽轉化為GSH，GCL是GSH生物合成的限速酶。GST是谷胱甘肽結合反應的關鍵酶，催化該反應的起始步驟。GPx是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。GST、GPx、GR、GCL、GSH在機體抗氧化中發揮重要作用。鎘暴露引起GSH水平升高，以及GR、GCL、GST、GPX活性上升，提示機體在盡力調動谷胱甘肽抗氧化系統以對抗鎘引起的氧化損傷。本試驗結果為研究鎘引起動物組織損傷的機制提供依據。

參考文獻：

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