自然殺傷T淋巴細胞對黑色素瘤細胞的免疫調節及殺傷功能實驗研究

黃建敏，師煜博，陳忠華

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科，廣西南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸疾病研究所，

廣西南寧 530021；3.華中科技大學同濟醫學院同濟醫院器官移植研究所，湖北武漢 430030)

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·論著·

自然殺傷T淋巴細胞對黑色素瘤細胞的免疫調節及殺傷功能實驗研究

黃建敏1，師煜博2△，陳忠華3

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科，廣西南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸疾病研究所，

廣西南寧 530021；3.華中科技大學同濟醫學院同濟醫院器官移植研究所，湖北武漢 430030)

摘要:目的探討自然殺傷T淋巴細胞(NKT細胞)在細胞免疫調節及殺傷功能中的作用。方法建立混合淋巴細胞培養(MLC)體系，B16F10-luc-G5細胞作為靶細胞，以總淋巴細胞為效應細胞。(1)調節效應實驗以NKT細胞或CD4+CD25+T淋巴細胞為調節細胞，分為3組：NKT組、CD4+CD25+T組、靶細胞空白對照組；另設有1640空白對照組(RPMI1640溶液)。(2)殺傷效應實驗以NKT或自然殺傷(NK)細胞為效應細胞，分為3組：NKT組、NK組、靶細胞空白對照組。混合培養24、48、72 h后，通過活體成像系統檢測該培養系統的靶細胞生物發光，以監測NKT細胞的調節及殺傷效應。結果(1)調節效應實驗：NKT組及CD4+CD25+T組測定光子數分別與兩空白對照組比較，以及NKT組內培養24 h與72 h時測得光子數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。(2)殺傷效應實驗：NKT組及NK組與靶細胞空白對照組所測光子數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；且培養24 、72 h時NKT組與NK組光子數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論NKT細胞具有抑制總淋巴細胞對靶細胞的殺傷效應，且抑制效應具有時間性，其調節作用較CD4+CD25+T淋巴細胞強。NKT細胞具有對靶細胞的殺傷效應，但較NK細胞弱。

關鍵詞:自然殺傷T淋巴細胞；自然殺傷細胞；CD4+CD25+T淋巴細胞；B16F10-luc-G5細胞；活體成像系統

人體體內有少許T淋巴細胞表面能表達自然殺傷細胞(NK細胞)特有的標志，這部分細胞稱為自然殺傷T淋巴細胞(NKT細胞)。NKT細胞參與體內免疫調節、維持免疫穩定、防止器官移植排斥，在抗腫瘤免疫中發揮著重要作用。可以通過分析NKT細胞是否具有調節總淋巴細胞的殺傷效應，研究T淋巴細胞在腫瘤免疫中的作用。本實驗主要應用活體成像系統(IVIS)，在混合淋巴細胞培養(MLC)中分析帶熒光素標記的B16F10-luc-G5黑色素腫瘤細胞，通過平均光子數的變化驗證NKT細胞是否具有抑制總淋巴細胞對靶細胞的殺傷效應，以及是否具備與NK細胞相似的殺傷靶細胞的作用。現將結果報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物及細胞系小鼠黑色素瘤細胞株B16F10-luc-G5購自美國Xenogen公司；雄性健康封閉群BALB/c小鼠購自華中科技大學同濟醫學院器官移植研究所動物中心。

1.2方法凍存腫瘤細胞快速融化，加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640生長培養基中，獲取BALB/c小鼠淋巴細胞后，與淋巴細胞分離液混合，分離并分選NKT細胞、NK細胞、CD4+CD25+T淋巴細胞。以總淋巴細胞為效應細胞，B16F10-luc-G5腫瘤細胞為靶細胞，效應細胞與靶細胞的比例為效靶比，建立MLC并進行分組。NKT組：效靶比為20∶1，每孔加總淋巴細胞5×104個、靶細胞2.5×103個；CD4+CD25+T組：效靶比為10∶1，每孔加總淋巴細胞2.5×104個、靶細胞2.5×103個；靶細胞空白對照組：每孔加靶細胞2.5×103個；每組均3個復孔；1640空白對照組：僅為RPMI1640溶液。MLC建立后繼續培養，分別于24、48、72 h檢測生物發光，加入細胞孔中顯像。

2結果

2.1NKT細胞和CD4+CD25+T淋巴細胞的分離與鑒定利用流式細胞儀分離Babl/c小鼠脾細胞獲得NKT細胞和CD4+CD25+T淋巴細胞，經流式細胞儀檢測其純度分別為94.6%、93.3%。見圖1～4(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

2.2NKT細胞的調節效應NKT組及CD4+CD25+T組分別與兩空白對照組測定光子數比較，以及NKT組內24 h與72 h時測得光子數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。通過IVIS法繪制MLC系統中靶細胞(B16F10-luc-G5細胞)生長狀態圖，見圖5(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。表明混合培養24、48、72 h時，NKT細胞和CD4+CD25+T細胞均抑制總淋巴細胞的殺傷功能。

2.3NKT細胞的殺傷效應NKT組各檢測時間點光子數均低于CD4+CD25+T組和靶細胞空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；而各時間點CD4+CD25+T組光子數與靶細胞空白對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。以IVIS結果繪制靶細胞生長狀態圖，見圖6(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

2.4NKT與NK細胞直接殺傷靶細胞的效能比較NKT組和NK組各檢測時間點光子數與靶細胞空白對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；且NKT組與NK組24及72 h時光子數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。以IVIS結果繪制靶細胞生長狀態圖，見圖7(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

表1　　不同時間點調節效應實驗MLC中靶細胞光子數比較

*：P<0.05，與1640空白對照組比較；#：P<0.05，與靶細胞空白對照組比較；△：P<0.05，與同組24 h時測得的光子數比較。

表2　　不同時間點殺傷效應實驗MLC中靶細胞光子數比較

*：P<0.05，與NKT組比較。

表3　　不同時間點直接殺傷靶細胞效應實驗MLC靶細胞光子數比較

*：P<0.05，與靶細胞空白對照組比較；#：P<0.05，與NK組比較。

3討論

NKT參與體內免疫調節、維持免疫穩定并防止器官移植排斥，在抗腫瘤免疫中發揮重要作用。本實驗的目的在于研究NKT細胞能否調節總淋巴細胞的殺傷效應，通過比較NKT細胞與經典的CD4+CD25+T調節細胞的體外調節功能，以及NKT細胞與NK細胞對腫瘤細胞的直接殺傷效應，分析NKT細胞的功能。

體外研究表明，在抗原刺激下，NKT細胞可被CD1d提呈的糖脂類抗原激活,α-半乳糖神經鞘胺醇(α-GalCer)為NKT細胞的一種高效、特異的刺激抗原。NKT細胞可迅速分泌大量具有免疫調節作用的細胞因子，類似于輔助性T淋巴細胞2(Th2)型分泌白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-13(IL-13)、干擾素-γ(IFN-γ) 等，從而影響免疫反應類型，實現對免疫應答和自身免疫的調節。Kawano等[1]從人外周血中分離Vα24 NKT細胞，經α-GalCer活化，與惡性黑色素瘤細胞株HMV-1、胰腺癌細胞株PANC-1等多種人類腫瘤細胞系進行作用，結果發現Vα14+NKT細胞具體外殺傷腫瘤細胞的效應，活化的Vα24 NKT細胞對多數腫瘤細胞均有明顯的殺傷作用。在未預先致敏的情況下，白細胞介素-12(IL-12)與α-GalCer共同活化的NKT細胞對多種腫瘤細胞系和自體腫瘤組織均具有明顯的細胞毒活性。由IL-12治療誘導出的NK1.1+V142Jα281+NKT細胞可以介導腫瘤排斥，過往輸注經IL-12活化的Vα14 NKT細胞可有效阻止小鼠B16黑色素瘤肝臟轉移灶的形成[2]。研究證明，NKT細胞被α-GalCer激活后分泌的IFN-γ在腫瘤排斥反應中起著關鍵作用[3]。Vα24+NKT細胞的細胞毒性是通過穿孔素介導的，并且T淋巴細胞受體(TCR)Vα24 、CD1d和α2腦苷脂也起一定作用[4]。NKT細胞并不直接殺傷腫瘤細胞，而是通過IFN-γ介導下游效應細胞，如NK細胞和CD8+T淋巴細胞的積聚并提高其對腫瘤的敏感性而發揮抗腫瘤效應[5]。α-GalCer和IL-12激活的NKT細胞可增強NK和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的抗腫瘤活性，也可促進抗原呈遞細胞(APC)活化與上調CD40L表達，從而進一步促進IL-12的產生，使腫瘤免疫得到加強[6]。α-GalCer可抑制許多腫瘤的肝轉移，且為激活的NKT細胞的腫瘤殺傷效應。NKT細胞既可通過識別靶細胞上的CD1d-ligand復合物直接介導抗腫瘤反應[6]，亦可通過分泌白細胞介素-2(IL-2)和IFN γ激活NK細胞，間接介導抗腫瘤反應[7]。

本文實驗結果證明，NKT在體外進行混合培養時，可發揮對B16F10-luc-G5細胞的殺傷效應，該殺傷效應具有時間性，隨時間的延長達到更大的靶細胞殺傷作用。通過與NK細胞的平行比較發現，NKT與其有相似的抗腫瘤功能。NK細胞是細胞復雜的免疫調節網絡中的重要組分，而NKT細胞是免疫細胞中一個具特定標志的T淋巴細胞亞群，不同于NK細胞，兩者均有抗腫瘤細胞效應。雖然NKT細胞在抗腫瘤能力上弱于NK細胞，兩者在機體內的功能和作用機制是否與體外實驗相似，還需進一步研究。

另外，NKT細胞可下調機體的免疫監視能力，導致腫瘤的發生。Moodycliffe等[8]發現，從紫外線照射的小鼠分離得到的NKT細胞，作為抑制性T淋巴細胞在調節紫外線誘發的皮膚癌細胞生長中具有重要作用，可抑制體內獲得性免疫的產生。紫外線輻射的致癌作用及引起的免疫抑制是通過NKT細胞來實現的[8]。本次實驗結果顯示，在MLC系統中，NKT可以抑制總淋巴細胞對B16F10-luc-G5細胞的殺傷效應，在培養24～48 h內可達到一定的抑制效應，但培養時間超過48 h后，該抑制效應明顯減弱，通過與經典的調節T細胞(CD4+CD25+T細胞)進行平行比較，NKT亦具有相似的抑制總淋巴細胞殺傷效應的作用。本次實驗可初步顯示NKT具有雙向效應，既具備抗瘤作用又有免疫抑制作用。因此，筆者認為需要對NKT進行更深入的研究，特別是其釋放的細胞因子的濃度及相關蛋白質組的變化，以期將針對NKT細胞的相關檢測數據應用于臨床醫學檢驗實驗室，以利于臨床疾病的有效診治。

綜上所述，NKT細胞在腫瘤免疫調節及腫瘤殺傷中起一定作用，國外臨床上已有針對NKT進行的腫瘤免疫靶向治療，已達到良好的效果，說明NKT細胞在抑制某些腫瘤的發生、發展機制中起著重要作用。

參考文獻

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Study on the immunoregulatory and lethal effects of natural killer T cells on melanoma cells in vitro

HuangJianmin1，ShiYubo2△，ChenZhonghua3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；2.InstituteofRespiratoryDisease,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；3.InstituteofOrganTransplantation,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430030,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the immunoregulatory and lethal effects of natural killer T lymphocytes(NKTs) in vitro.MethodsThe mixed lymphocyte cultured(MLC) system was established, in which the B16F10-luc-G5 cells were set as target cells, the total lymphocyte cells were set as effector cells.(1)In the experiment on immunoregulatory effects, NKT lymphocytes or CD4+CD25+ T lymphocytes were set as regulating cells, there was three groups, including the NKT group, CD4+CD25+ T group and pure target cell control group.Otherewise, the 1640 blank control group was set by only adding RPMI1640 solution.(2)In the experiment on antitumor effects, the NKT or natural killer(NK) lymphocytes were set as killer cells, there was three groups, including the NKT group, NK group and pure target cell control group.Mixed culturing 24, 48 and 72 hours, the bioluminescence of target cells in MCL system was detected by using the in vivo imaging system.Results(1)In the experiment on immunoregulatory effects,there were statistically significant differences in measured average photon numbers between NKT group, CD4+CD25+ T group and the two control groups(P<0.05).The statistically significant differences were also found in the NKT group between 24 hours and 72 hours (P<0.05).(2)In the experiment on antitumor effects,there were statistically significant differences in measured average photon numbers, when the NKT group and NK group were compared to the pure target cell control group(P<0.05).After culturing 24 and 72 hours,statistically significant differences were found between NKT group and NK group(P<0.05).ConclusionThe NKT cells could inhibit the lethal effects of lymphocyte cells on target cells, and the inhibitory effects are changed by the length of culturing.Compared with the CD4+CD25+T lymphocytes, NKT lymphocytes have strongger regulatory effects.Additionally, the NKT cells have lethal effects on target cells, which might be weaker than that of NK cells.

Key words:natural killer T cells；natural killer cells；CD4+CD25+ T lymphocytes；B16F10-luc-G5 cells；in vivo imaging system

(收稿日期：2015-12-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.014

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0613-03

作者簡介：黃建敏，男，講師，主要從事臨床免疫與微生物學檢驗研究。△通訊作者，E-mail：phoenixdan@126.com。