表皮葡萄球菌生物膜形成與細菌耐藥性的相關性分析

葉楊芹，包裕杰，馬　珂，張雯雁，奚　婷，陳芳瑩,宗　明，范列英

(上海市東方醫院/同濟大學附屬東方醫院檢驗科，上海 200120)

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·論著·

表皮葡萄球菌生物膜形成與細菌耐藥性的相關性分析

葉楊芹，包裕杰，馬珂，張雯雁，奚婷，陳芳瑩,宗明，范列英

(上海市東方醫院/同濟大學附屬東方醫院檢驗科，上海 200120)

摘要:目的探討表皮葡萄球菌臨床分離株生物膜的形成情況,分析其生物膜形成與細菌耐藥性的相關性。方法收集2014年1月至2015年2月住院患者血標本分離出的表皮葡萄球菌62株，采用生物膜形成試驗和聚合酶鏈式反應(PCR)擴增試驗檢測細菌生物膜，并采用紙片擴散法(K-B法)進行細菌藥物敏感性試驗。結果利用生物膜形成試驗檢出生物膜陽性菌株23株，檢出率為37.1%；PCR擴增試驗檢出icaA基因27株，檢出率為43.5%，差異無統計學意義(P>0.05)；兩種方法同時陽性的菌株為14株。生物膜陽性菌株對所測抗菌藥物的耐藥率普遍高于生物膜陰性菌株，其中對慶大霉素、青霉素G、苯唑西林、左旋氧氟沙星、頭孢西丁的耐藥率比較差異有統計學意義(P<0.05)，所有菌株對萬古霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/達福普汀均敏感。結論兩種方法對表皮葡萄球菌生物膜的檢出率無明顯差異，生物膜陽性菌株耐藥率普遍高于生物膜陰性菌株。

關鍵詞:表皮葡萄球菌；生物膜；耐藥性；ica操縱子

表皮葡萄球菌是一類凝固酶陰性的革蘭陽性球菌，是寄生于人體的正常菌群之一，屬于條件致病菌。近年來，隨著多種插管、透析技術、人工心瓣膜、人工晶體、人工關節等侵入性醫療材料的使用，表皮葡萄球菌已經成為醫院感染的主要病原菌之一。表皮葡萄球菌容易黏附于異物表面，形成細菌生物膜，增加臨床治療難度，造成嚴重危害[1]。本研究以引起血流感染的表皮葡萄球菌為研究對象，利用生物膜形成實驗及分子生物學方法篩選生物膜陽性細菌，并進一步分析表皮葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥特征，以期更好地了解表皮葡萄球菌耐藥性與生物膜形成的相關性，為指導臨床有效地預防及控制表皮葡萄球菌感染奠定基礎。

1材料與方法

1.1菌株來源收集本院2014年1月至2015年2月住院患者血液標本分離得到的表皮葡萄球菌62株(單瓶血培養瓶陽性檢出視為污染菌，不作為實驗用菌株)。以表皮葡萄球菌ATCC12228(SE ATCC12228)為生物膜形成的陰性對照株，以金黃色葡萄球菌ATCC25923為藥敏質控菌株及icaA陰性對照菌株。

1.2儀器與試劑Micro-Scan Walkaway-96 全自動微生物鑒定系統(德國西門子公司)，ABI-7000熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)分析儀(美國應用生物系統公司)，Tanon-2500凝膠成像系統(上海天能公司)，Biotek-Elx808U酶標儀(美國伯滕儀器有限公司)。PCR反應所需試劑及引物購自美國 Invitrogen公司；LB肉湯、結晶紫、Bouin固定液、瓊脂糖均為國產分析純；抗菌藥物紙片購自英國Oxoid公司；血瓊脂平板、M-H瓊脂平板購自北京賽默飛世爾有限公司。

1.3方法

1.3.2PCR擴增檢測icaA基因(1)表皮葡萄球菌基因組DNA的提?。簩⑴R床分離的表皮葡萄球菌及指控菌株接種于血平板上，35 ℃培養過夜。用接種環取適量菌于300 μL無菌生理鹽水中，充分混勻后12 000 r/min離心5 min，去上清。在上清中加入300 μL無菌水，充分混勻，煮沸15 min，12 000 r/min離心5 min，留上清。(2)PCR擴增檢測icaA基因：通過PCR的方法特異性擴增icaA 基因。50 μL PCR擴增體系：25 mmol/L氯化鎂(MgCl2)3 μL，10 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL，0.5 μL)，10×PCR(25 mmol/L，5 μL)，上游引物5′-GAT GGG CTC AAG GCG GGC AT-3′(50 pmol/L，1 μL)，下游引物5′-GAT GGG CTC AAG GCG GGC AT-3′(50 pmol/L，1 μL)，DNA模板5 μL。PCR反應擴增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環，72 ℃ 5 min。(3)PCR擴增產物的分析：1%瓊脂糖凝膠于1×TAE緩沖液，用0.5 μg/mL溴化乙錠染色，150 V電壓下電泳約30 min，將PCR擴增所得特異性片段克隆測序，并在MegaBlast上進行基因序列比對。

1.3.3藥敏試驗采用紙片擴散法(K-B法)對所有表皮葡萄球菌臨床分離株及質控菌株做藥物敏感性試驗，結果按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI )2013版判斷標準執行[3]。

1.4統計學處理采用WHONET5.6軟件進行細菌耐藥性分析。采用SAS6.12軟件進行數據處理與統計分析，計數資料以例數或百分率表示，采用χ2檢驗進行比較分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1半定量黏附試驗結果利用生物膜形成實驗檢出生物膜陽性菌株23株，檢出率為37.1%，部分結果見圖1(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

2.2PCR擴增結果62株表皮葡萄球菌臨床分離株中有27株檢出icaA，檢出率為43.5%，特異性片段長度在300～400 bp之間，見圖2。將PCR擴增得到特異性片段克隆測序，得到片段長度為386 bp，經與GeneBank比對為icaA基因。

泳道1~4、6、7、9：表皮葡萄球菌臨床分離株；泳道8：金黃色葡萄球菌ATCC25923；泳道5：DL500 ladder。

圖2PCR擴增結果

2.3兩種方法檢測生物膜的結果比較ica基因檢測與半定量黏附試驗檢測菌株生物膜陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=0.41，P>0.05)。見表1。

表1　　兩種方法檢測生物膜的結果比較(n)

2.4藥敏試驗結果生物膜陽性菌株與生物膜陰性菌株對慶大霉素、青霉素G、苯唑西林、左旋氧氟沙星、頭孢西丁的耐藥率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；對其余檢測藥物的耐性比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　　表皮葡萄球菌臨床分離株細菌耐藥性比較[n(%)]

-：無數據。

3討論

生物膜具有保護細菌、對抗抗菌藥物、促進細菌逃避機體免疫系統的作用，使細菌對抗菌藥物和機體免疫力的抵抗能力大大增強，出現耐藥，甚至多重耐藥，為臨床預防及治療細菌感染帶來巨大的挑戰。因此，正確認識表皮葡萄球菌的生物膜及其形成機制和相關因子的調控，將對臨床防治起到有效的指導作用。

3.1表皮葡萄球菌生物膜形成能力分析表皮葡萄球菌形成生物膜除了受周圍環境的影響外，還受到自身遺傳基因的調控。多糖胞間黏附素(PIA)是表皮葡萄球菌生物膜形成的必需成分[4-8]，表皮葡萄球菌可產生大量PIA。目前，明確的是PIA合成的基礎為ica基因，ica基因位點包含一個操縱子結構icaADBC，4個基因序列依次排列，其中icaD基因位于icaA和icaB基因之間，且與二者有部分重疊。國內邢銘友等[9]研究發現表皮葡萄球菌ica操縱子的存在與生物膜表型密切相關，PIA的合成是生物膜形成的關鍵環節。

本研究利用生物膜形成試驗(半定量黏附試驗)檢測出的生物膜陽性菌株為23株，檢出率為37.1%。；而利用PCR擴增icaA基因檢測生物膜測得陽性菌株27株，檢出率為43.5%?；驒z測的檢出率略高于生物膜形成試驗,但經統計學分析兩種方法檢出率比較差異無統計學意義(P>0.05)。有13株菌株icaA基因檢測陽性，而生物膜形成試驗結果為陰性。初步認為可能的原因有以下兩種：(1)檢測到icaA 基因可能由于某種缺失或抑制等原因得不到充分的表達或完全沒有表達，因而無法形成生物膜；(2)本試驗中檢測的ica基因為icaA基因型，并沒有對icaD、icaC、icaB基因型進行檢測,而icaA、icaD和icaC這3個基因型，任何缺失或突變都有可能影響生物膜的形成，因此，所測菌株可能由于缺失或突變等原因不表達或弱表達icaD、icaC、icaB基因而無法形成生物膜。此外，icaA、icaD、icaB、icaC基因的表達還受其他生物因子(如SigB因子、RsbU因子)及環境因子(氯化鈉、乙醇)的影響[10]。確切原因涉及表皮葡萄球菌生物膜的基因調控等多方面因素，機制較為復雜，需要進一步學習、研究。本研究結果中還有9株菌株為生物膜形成試驗陽性而基因檢測結果為陰性。其原因可能是表皮葡萄球菌生物膜的形成受到除受icaA、icaD、icaB、icaC調控外，還受到其他調控機制的影響，值得深入探討[11-12]。

3.2表皮葡萄球菌生物膜形成與細菌耐藥性的相關性生物膜陽性菌株對慶大霉素、青霉素G、紅霉素、左旋氧氟沙星的耐藥率均在65%以上，而對苯唑西林、克林霉素、頭孢西丁的耐藥率在50%以下。對復方磺胺甲噁唑和利福平也存在一定程度的耐藥。生物膜陰性菌株耐藥率整體低于生物膜陽性菌株，其中對慶大霉素、青霉素G、苯唑西林、左旋氧氟沙星、頭孢西丁的耐藥率比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示生物膜陽性細菌對上述抗菌藥物的耐藥性更明顯。隨著細菌的生長繁殖及抗菌藥物的使用，敏感菌群受到抑制，而耐藥菌得到優勢生長，細菌形成生物膜后定植在體內，難以清除，而生物膜又極大地限制了抗菌藥物的作用效果，增加了臨床治療難度。此外，未發現對萬古霉素、奎奴普丁/達福普汀和利奈唑胺耐藥的菌株。

綜上所述，本研究發現表皮葡萄球菌臨床分離株有一定的生物膜形成能力，因本次試驗所用菌株分離自住院患者血液，分析生物膜形成可能與細菌從皮膚定植部位入侵或靜脈留置針使用增加定植黏附風險等有關。形成生物膜的菌株較生物膜陰性菌株耐藥率高，提示應該采取有效手段消毒滅菌，降低生物膜形成率，減少醫療及經濟負擔。

參考文獻

[1]Wojtyczka RD，Orlewska K，Kepa M，et al.Biofilm formation and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus epidermidis strains from a hospital environment[J]．Int J Environ Res Public Health，2014，11(5):4619-4633.

[2]Christensen GD，Simpson WA，Younger JJ，et al．Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates:a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices[J]．J Clin Microbiol，1985，22(6):996-1006.

[3]Clinical Laboratory Standards Institute．M100-S23 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]．Wayne，PA，USA：CLSI，2013．

[4]Cue D，Lei MG，Lee CY．Genetic regulation of the intercellular adhesion locus in staphylococci[J]．Front Cell Infect Microbiol，2012，2(1):38.

[5]Yu D，Zhao L，Xue T，et al．Staphylococcus aureus autoinducer-2 quorum sensing decreases biofilm formation in an icaR dependent manner[J]．BMC Microbiol,2012，12(4)：1-12．

[6]Ziebuhr W，Dietrich K，Trautmann M，et al．Chromosomal rearrangements affecting biofilm production and antibiotic resistance in a Staphylococcus epidermidis strain causing shunt-associated ventriculitis[J]．Int J Med Microbiol，2000，290(1):115-120.

[7]Arciola CR，Campoccia D，Ravaioli S，et al．Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm:structural and regulatory aspects[J]．Front Cell Infect Microbiol，2015(5):7.

[8]Solati SM，Tajbakhsh E，Khamesipour F，et al．Prevalence of virulence genes of biofilm producing strains of Staphylococcus epidermidis isolated from clinical samples in Iran[J]．AMB Express，2015，5(1):134.

[9]邢銘友，劉莉娜，宋世會，等．表皮葡萄球菌ica操縱子與細胞間多糖黏附素及生物膜表型的相關性[J]．華中科技大學學報:醫學版，2008，37(4)：449-452．

[10]Luther MK，Bilida S，Mermel LA，et al．Ethanol and isopropyl alcohol exposure increases biofilm formation in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis[J]．Infect Dis Ther，2015，4(2)：219-226．

[11]Salaberry SR，Saidenberg AB，Zuniga E，et al．Virulence factors genes of Staphylococcus spp.isolated from caprine subclinical mastitis[J]．Microb Pathog，2015(85)：35-39．

[12]Büttner H，Mack D，Rohde H．Structural basis of Staphylococcus epidermidis biofilm formation:mechanisms and molecular interactions[J]．Front Cell Infect Microbiol，2015(5)：14．

Analysis on correlation between biofilm formation and bacterial resistance in Staphylococcus epidermidis

YeYangqin，BaoYujie，MaKe，ZhangWenyan，XiTing，ChenFangying，ZongMing，FanLieying

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiEastHospital/EastHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200120,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the formation of biofilm in clinical isolates of Staphylococcus epidermidis,and to analyse the correlation between biofilm formation and antibacterial resistance of Staphylococcus epidermidis.MethodsA total of 62 strains of Staphylococcus epidermidis isolated from blood specimens of inpatients with bloodstream infection,from January 2014 to February 2015,were collected.The biofilm formation of Staphylococcus epidermidis was detected by using the semi-quantitative adherence assay and polymerase chain reaction(PCR) amplification experiment.The antibacterial susceptibility test was carried out according to K-B method.ResultsThe positive rate of biofilm formation detected by using the semi-quantitative adherence assay and PCR for icaA gene were 37.1%(23 strains) and 43.5%(27 strains) respectively,and there was no statistically significant difference(P>0.05).There were 14 positive strains detected by both methods.The resistance rates of strains producing biofilm to antibacterial agents were generally higher than those of non-producing biofilm strains,and there were statistically significant differences in resistance rates of strains to gentamicin,penicillin,oxacillin,levofloxacin and cefoxitin(P<0.05).All bacteria were sensitive to vancomycin,linezolid and quinupristin/dalfopristin.ConclusionThere is no significant difference between the two methods in detecing biofilm formation.The resistance rates of strains producing biofilm to antibacterial agents were generally higher than those of non-producing biofilm strains.

Key words:Staphylococcus epidermidis；biofilm；drug resistance；ica operon

(收稿日期：2015-09-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.016

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0618-03

作者簡介：葉楊芹，女，主管檢驗技師，主要從事臨床微生物學與檢驗研究。