宮頸癌患者外周血CD4+CD25+調節性T淋巴細胞與白細胞介素-17水平及其相關性研究

周勇軍，李龍平，王新華

(益陽市中心醫院檢驗科，湖南益陽 413000)

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·臨床研究·

宮頸癌患者外周血CD4+CD25+調節性T淋巴細胞與白細胞介素-17水平及其相關性研究

周勇軍，李龍平，王新華

(益陽市中心醫院檢驗科，湖南益陽 413000)

摘要:目的探討外周血CD4+CD25+調節性T淋巴細胞(Tr細胞)和白細胞介素-17(IL-17)水平在宮頸癌患者中的變化及其相關性。方法選取2014年1月至2015年3月該院確診宮頸癌患者60例(宮頸癌組)和查體的健康女性60例(健康對照組)，采用流式細胞儀檢測外周血Tr細胞數量及占CD4+細胞百分比，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IL-17水平。結果宮頸癌組外周血Foxp3+Tr、Tr、CD4+T淋巴細胞百分比，Foxp3+Tr/Tr、Tr/ CD4+T淋巴細胞比值及血清IL-17水平均較健康對照組明顯升高，而IL-17/Tr比值明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。宮頸癌組患者外周血CD4+CD25+Tr細胞水平與血清IL-17水平呈正相關(r=0.768，P<0.05)。結論宮頸癌患者存在細胞免疫功能紊亂，IL-17與Tr細胞比值失衡可能在宮頸癌發病機制中起一定的作用。

關鍵詞:宮頸癌；CD4+CD25+調節性T淋巴細胞；白細胞介素-17

宮頸癌是婦科常見的生殖系統惡性腫瘤之一，其發病率僅次于乳腺癌。越來越多的研究表明，腫瘤的發生、發展與腫瘤免疫逃逸密切相關，CD4+CD25+調節性T淋巴細胞(Tr細胞)是一種新型免疫抑制細胞，能維持自身耐受和免疫穩定，同時抑制免疫系統對腫瘤的免疫應答，其獨特的免疫抑制作用可能在腫瘤免疫逃逸中起了“主干”作用[1]。有研究表明，宮頸癌患者體內存在CD4+CD25+Tr細胞比例失調，腫瘤負荷與宮頸癌患者體內CD4+CD25+Tr細胞水平有關，提示CD4+CD25+Tr細胞表達異常參與了宮頸癌的發生、發展[2]。炎癥和腫瘤之間可能存在一定的關系，慢性感染和炎癥能介導一系列炎性介質(如細胞因子、酶、趨化因子等)一起造成炎癥微環境，被認為是宮頸癌發生、發展的重要原因之一。白細胞介素-17(IL-17)是輔助性T淋巴細胞17(Th17)分泌的前炎性細胞因子，作為細胞核心的炎性因子具有強有力的誘導能力，可促進細胞增殖和血管生成，從而發揮促進慢性炎癥和腫瘤生長的作用[3]。本研究通過檢測60例，宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Tr細胞及IL-17水平的表達，旨在進一步探討IL-17和CD4+CD25+Tr細胞在宮頸癌發生、發展中的作用及其發病機制，為宮頸癌的臨床免疫調節治療提供一定的理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料2014年1月至2015年3月本院婦科收治的經臨床婦科檢查診斷和活檢后病理確診的初次就診宮頸癌患者60例，納入宮頸癌組，年齡32～79歲，平均(40.57±15.62)歲，所有患者無其他系統惡性腫瘤及轉移性腫瘤，未經放、化療治療及內分泌治療和免疫治療，取材前3 d內無陰道沖洗及陰道用藥史。另選取本院查體的健康女性60例作為健康對照組，年齡26～75歲，平均(38.73±12.23)歲，均有性生活史，均為非妊娠狀態，均無子宮切除和宮頸手術史，均排除近期感染和自身免疫病史，均未使用糖皮質激素和非甾體類藥物。所有標本的收集均經患者或其家屬同意，簽署知情同意書。兩組年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具可比性。

1.2儀器與試劑熒光素標記的單克隆抗體：異硫氰酸熒光素標記CD4(CD4-FITC)、藻紅蛋白標記CD25(CD25-PE)、異硫氰酸熒光素標記IgGI(IgGI-F1TC)和藻紅蛋白標記IgGI(IgGI-PE)均購自美國BD公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自美國Linco公司。Beckman Coulter EP-ICS XL流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.3方法

1.3.1外周血CD4+CD25+Foxp3+Tr細胞檢測取健康女性查體當日和患者入院第2天清晨靜脈新鮮血液5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，以淋巴細胞分離液得淋巴細胞，取分離的T淋巴細胞懸液100 μL，分別加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的單克隆抗體各20 μL，同型對照分別為IgGI-F1TC、IgGI-PE，混勻，避光孵育25～30 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清。將細胞懸浮于0.5 mL PBS中，振蕩混勻后待測。應用流式細胞儀檢測宮頸癌組和健康對照組外周血單個核細胞(PBMC)中CD4+CD25+Foxp3+Tr細胞。

1.3.2IL-17檢測所有受試者清晨空腹抽取靜脈血5 mL，3 000 r/min離心5 min，血清分離后放-20 ℃冰箱保存備用。采用ELISA試劑盒測定血清IL-17水平，嚴格按試劑說明書進行測定。

2結果

2.1兩組外周血Tr細胞及血清IL-17水平比較宮頸癌組外周血Foxp3+Tr、Tr、CD4+T淋巴細胞百分比及Foxp3+Tr/Tr、Tr/ CD4+T淋巴細胞比值及血清IL-17水平均較健康對照組明顯升高，而IL-17/Tr比值明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　　兩組外周血Tr細胞及血清IL-17水平比較±s)

2.2宮頸癌組外周血Tr細胞表達與血清IL-17水平的相關性分析將Tr細胞表達水平與血清IL-17水平進行相關性分析，宮頸癌組患者血清IL-17水平越高，外周血CD4+CD25+Tr細胞表達水平越高，二者呈正相關(r=0.768，P<0.05)。

3討論

宮頸癌是發生在宮頸鱗狀上皮細胞和宮頸管內膜柱狀上皮細胞交界處的最常見的惡性腫瘤之一，其發病率有明顯上升趨勢，發病年齡呈現年輕化趨勢。相關研究顯示，宮頸癌的發生、發展是多因素共同作用導致的，經常規腫瘤細胞減滅術及化療得以有效緩解，但依然有相當一部分患者存在復發和遠處轉移的可能，從而影響卵巢癌的治療療效與預后，其中腫瘤免疫逃逸起“關鍵”作用，腫瘤在發生、發展過程中演化出逃避免疫監視的方式，導致宿主不能有效清除腫瘤。近年來的研究表明，CD4+CD25+Tr細胞是一群具有免疫抑制功能的T淋巴細胞亞群，其主要通過細胞與細胞接觸、細胞溶解、競爭性抑制、分泌抑制性細胞因子、間接抑制等方式發揮作用，在維持機體免疫穩定、調控免疫應答方面起重要作用，Tr細胞的免疫無能和免疫抑制使得腫瘤免疫逃逸，可能是腫瘤免疫逃逸中的關鍵因素[4-5]。近年來研究表明，肝癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥患者外周循環血中均發現Tr細胞增多，Tr細胞可通過抑制體內的T淋巴細胞活化從而抑制抗腫瘤免疫反應，在維持腫瘤免疫耐受中發揮重要作用，Tr細胞與腫瘤進展及不良預后密切相關[6]。Foxp3表面分子是叉頭翼狀螺旋轉錄因子的總稱，特異性表達在Tr細胞上，是Tr細胞的一個特異性標志，Tr細胞活化可導致其表達Foxp3增加，Foxp3表達在Tr細胞的發育和功能上起重要作用[7]。IL-17是近年來發現的一種促炎細胞因子，是由活化的人CD4+T淋巴細胞產生的重要細胞因子，作為一種獨特的多效性細胞因子，晚期腫瘤患者的外周血及腫瘤組織中均可查見分泌IL-17的細胞，IL-17能促進細胞增殖，并發揮著促進新生血管生成的作用，通過促進血管生成及腫瘤細胞的增殖，參與腫瘤的發生與發展。雖然，目前已經有大量的研究證實Tr細胞能夠抑制T淋巴細胞的免疫應答，導致腫瘤細胞的免疫逃逸，但是關于宮頸癌患者Tr細胞與IL-17表達水平的變化及兩者相互作用關系的研究報道較少。本研究通過檢測宮頸癌患者Tr細胞與血清IL-17表達水平的變化，深入研究宮頸癌患者的免疫抑制機制，以期為宮頸癌患者尋找高效的免疫治療方案提供一定的理論依據。

本研究發現，宮頸癌組患者外周血Foxp3+Tr、Tr、CD4+細胞百分比，Foxp3+Tr/Tr、Tr/ CD4+T比值，以及血清IL-17水平均較健康對照組明顯升高，而IL-17/Tr明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Tr細胞數量升高可以反映腫瘤患者免疫系統存在抑制狀態，由此可能導致機體自身有效的免疫抑制功能增強，減弱了免疫監視作用，在腫瘤的逃逸機制中發揮作用，可以保護腫瘤細胞，提示宮頸癌的發生與機體免疫狀態密切相關，尤其是T淋巴細胞介導的免疫反應，宮頸癌機體處于一種潛在的免疫抑制狀態[8]。有研究發現，IL-17基因低甲基化導致IL-17高表達，IL-17能誘導腫瘤特異性殺傷性T淋巴細胞的活性及功能增強，同時誘導抗腫瘤保護性免疫應答的形成，從而發揮其抗腫瘤活性[9]。宮頸癌患者外周血Foxp3+Tr細胞與Tr細胞的比值較對照組明顯升高，表明Foxp3+Tr在宮頸癌細胞免疫逃逸中發揮著重要作用，對宮頸癌的發生、發展起重要推動作用。有研究發現，FoxP3表達在宮頸癌組織中增高，并與P16INK4a(人乳頭瘤病毒整合到宿主細胞的關鍵標志)表達相關，與腫瘤大小呈正相關，表明FoxP3在宮頸癌的發生中發揮重要作用[10]，與本研究相符。有研究表明，FoxP3+Tr介導的宮頸癌免疫逃逸與前列腺素E2(PGE2)密切相關，PGE2能誘導白細胞介素-10(IL-10)的產生并抑制白細胞介素-12(IL-12)的產生，IL-10具有免疫抑制功能，而IL-12具有增強機體抗腫瘤免疫效應功能，從而打破了免疫抑制與免疫效應之間的平衡，使機體的免疫監視功能下降，提示FoxP3的功能性高表達可能為導致宮頸癌發病的原因之一[11]。相關性分析結果表明，IL-17表達水平與CCD4+CD25+Tr細胞表達水平呈正相關，IL-17水平越高，CD4+CD25+Tr細胞表達水平越高，表明血清IL-17在宮頸癌發病機制上發揮重要作用。Th17的主要效應因子是IL-17，IL-17細胞和Tr細胞之間存在著反向分化的機制，Tr細胞的表達較IL-17細胞的表達升高更明顯，呈現優勢表達，導致了IL-17/Tr比值呈下降趨勢，說明在宮頸癌患者中這種免疫平衡狀態被打破，導致了Th17細胞和Tr細胞表達水平升高，并且隨著腫瘤的發展而逐漸升高，這可能是宮頸癌發生的機制之一[12-13]。

綜上所述，CD4+CD25+Tr細胞和IL-17水平的升高可能參與了宮頸癌的發生、發展，機體的免疫調節功能異常加劇IL-17/Tr失衡，從而導致宮頸癌的發生，在外周血中的水平可能成為監測患者體內細胞免疫狀態和機體抗腫瘤免疫應答的指標，在疾病的診斷、預后和腫瘤免疫治療中有很好的應用前景。

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(收稿日期：2015-09-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.049

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0685-03