淺談上海市臨床PCR實驗室的建立和管理

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淺談上海市臨床PCR實驗室的建立和管理

楊德平1,2

(1.上海市浦東新區周浦醫院檢驗科，上海 201318；2.上海同濟大學醫學院臨床醫學系，上海 200092)

聚合酶鏈式反應(PCR)是由美國Kary Mullis于1983年發明的[1]。它有非常高的檢測靈敏度，并且還有快速、簡便、特異等優點，能將研究所需要的基因在試管內迅速擴增至幾十萬甚至上百萬倍。由于PCR技術優點多，被越來越廣泛地應用在醫學領域，很多醫療機構相繼建立了臨床PCR實驗室。因業務需要上海市浦東新區周浦醫院也建立了PCR實驗室，筆者參與了從PCR實驗室的建立到接受上海市專家審核組審核，再到正常運行的全過程，在實驗室的建立和管理上累積了一定的經驗，并產生了自己的看法。現總結報道如下，以供上海市需要開展PCR實驗室的醫療機構參考。

1PCR實驗室的創建和完善

PCR技術現已被越來越廣泛地應用在臨床實驗室，由于PCR技術對檢測的核酸進行了大批量的擴增，這就容易導致PCR實驗室污染而出現假陽性結果；另外由于PCR技術要求高，中間環節比較多，如果檢測過程出現問題(如忘加樣品)就可能導致假陰性結果。因此，臨床上要想開展該項技術，就必須要通過有關部門的技術審核，同時在管理方面一定要規范化。要想順利通過專家審核把實驗室開展起來，就要認真對照申報上海市PCR實驗室必需具備的條件逐條進行分析、完善。

1.1PCR實驗室申報前準備首先要了解在上海市申辦PCR實驗室需要準備的材料，需要的條件，然后對照要求一一完成。上海市PCR實驗室申辦必需具備的材料和條件如下所述。(1)醫療機構執業許可證副本首頁及校驗登記復印件(加蓋單位公章)。(2)該醫療技術臨床應用能力在醫療機構執業許可證扉頁登記情況復印件(加蓋單位公章，復審、擴項需提交)。(3)與該技術有關的技術人員資格證書復印件(加蓋單位公章)；挑選業務水平較好的有資格的人員[2]，均經過原衛生部臨床檢驗中心或區臨床檢驗中心理論和操作培訓并通過考試取得合格證[3]。(4)與該技術有關的實驗室平面圖；在實驗室設計上，建立單流向、一體化的臨床定量PCR實驗室是安全準確進行基因擴增檢驗和保障生物安全的重要措施[4]；實驗室平面圖主要包括3個部分(Ⅰ區試劑準備區，Ⅱ區標本制備區，Ⅲ區擴增區)。(5)醫療機構醫學倫理審查報告(相關技術審核辦法規定的，初審、擴項需提交；另附倫理委員會成員姓名、專業、職務、職稱等情況)。(6)醫療機構相關臨床科室出具的臨床評價報告(加蓋單位醫務部門公章，初審、擴項需提交)；可以從需要開展項目的臨床需求，可以解決的臨床問題，以及臨床意義出發。臨床科室提供、有臨床主任簽字、醫務科蓋章。(7)與該項目相關的試劑注冊證書復印件(初審、擴項需提交)。(8)擬開展檢測項目方法學驗證報告(初審、擴項需提交)；若要開展的項目結果是數值型的，則項目的性能驗證參數包括正確度、精密度、線性范圍、檢測下限；若要開展的項目結果報告是陰陽性，則項目的性能驗證參數包括精密度、符合率。(9)參加室間質量評價活動反饋結果復印件，或證明其檢測質量的其他相關資料(加蓋單位公章)。(10)擬開展檢測項目報告樣單(初審、擴項需提交)。(11)該技術的質量手冊、程序文件、作業指導書(初審、擴項需提交)；在上海市這條很重要，每個臨床PCR實驗室要根據自己開展項目的具體要求，結合自身的實際情況進行編寫，專家來初審的時候比較關注，需要認真準備，包括基因擴增檢測的標準化操作規程(SOP)和相關的各種表格。(12)衛生行政部門要求的其他相關文件。(13)國內外有關該技術研究和使用情況的檢索報告及技術資料(申請在本市首次開展的醫療技術即新技術初審、擴項需提交)，這條在上海市主要是提交的申請表里面需要填寫。在準備上述條件的同時，還要購買PCR擴增儀、高速離心機、恒溫金屬浴等儀器設備和相應的項目試劑。

1.2PCR實驗室審核流程上海市醫療機構分子診斷計數審核工作流程圖，見圖1。其中在現場審核過程中將按照以下幾個步驟進行。(1)首次會議：①參加人員包括審核組全體成員、PCR實驗室全體成員；②審核組工作安排介紹；③實驗室負責人介紹實驗室基本情況(提供一份書面提綱)。(2)現場參觀：參加人員包括審核組全體成員。(3)現場審核：①參加人員包括審核組全體成員；②《上海市臨床基因擴增檢驗技術審核檢查表》中規定內容；③有關記錄；④現場提問；⑤現場樣品測試。(4) 審核組會議：評審專家獨立出具審核意見，參加人員包括審核組全體成員。(5)末次會議：①參加人員包括審核組全體成員、PCR實驗室全體成員；②審核組宣布整改要求及審核意見；③實驗室負責人講話。需特別注意的是在專家審核組提出整改意見后，一定要在1個月內把整改報告提交到上海市臨床檢驗中心。

圖1　　上海市醫療機構分子診斷新技術審核工作流程圖

1.3不斷改進完善對評審專家在現場審核過程中提出的整改意見和合理建議及時地進行改進完善。

2PCR實驗室的日常管理

PCR實驗室最常見也是最重要的問題是污染問題，它直接影響著檢測結果的準確性。因此，要嚴格控制每一個操作環節，最大限度地減少實驗室污染問題。

2.1儀器設備的管理PCR擴增儀、高速離心機、恒溫金屬浴和生物安全柜是PCR實驗室的主要儀器，每次工作前后對這些儀器設備進行擦拭清潔(宜用75%的乙醇，不用次氯酸鈉)，工作結束后用紫外線燈進行照射消毒，同時要確保儀器設備有良好的工作性能，如有問題及時報修，并同時做好記錄。

2.2試劑耗材的管理試劑耗材的好壞直接影響檢測結果，所以試劑耗材的管理也相當重要，最好選用高質量的PCR儀器配套試劑和PCR實驗室專用耗材(例如帶濾芯的槍頭)。如果試劑耗材的選購沒有問題,接下來就要考慮試劑耗材的儲存,試劑耗材的儲存條件和儲存位置也非常講究,要嚴格按照要求來做，以試劑標本不混放，防止試劑大規模污染，先用效期短的試劑后用效期長的試劑，不浪費、不使用過期試劑，不同批號試劑不混放，不同項目試劑區別存放，新舊試劑不混放為原則[5]。

2.3環境衛生的管理嚴格遵守從Ⅰ區→Ⅱ區→Ⅲ區的單一方向制度，不得反向進入前一個區。在各個實驗區域使用帶有明顯區別標志的工作服和物品(如不同顏色)，當工作人員離開時不得將本區的工作服和物品帶至其他區域，盡量減少在實驗區內不必要的走動以減少交叉污染的可能性[6]。每個區都應該有獨立的清潔工具，每個區的清潔工具不能混用，清潔的時候應該從Ⅰ區→Ⅱ區→Ⅲ區單一方向進行清潔消毒，工作結束后用75%的乙醇擦拭工作臺面，然后用紫外線燈進行照射,最后要注意實驗室的通風換氣。從上述要求可以看出要想得到準確可靠的檢測結果，把好PCR實驗室環境衛生這一關也是非常重要的。

2.4人員培訓的管理人員是PCR實驗室的核心，控制著實驗室的每一個環節,每一個錯誤或不當的舉動都有可能影響檢測結果，所以對人員的要求相當高。PCR實驗室的工作人員必須是取得PCR上崗證的人員，對那些剛進入PCR實驗室還沒有拿到PCR上崗證的人員，必須在取得PCR上崗證的同事的指導下進行工作，最后檢測報告由取得PCR上崗證的人員出具，同時新員工要盡快參加國家衛生和計劃生育委員會或上海市臨床檢驗中心的培訓，爭取在最短的時間內取得PCR上崗證。另外，要求員工能善于發現并解決問題，能嚴格按照PCR實驗室的操作規程操作。

3PCR實驗室的質量管理

3.1室內質量管理室內質控就是用一種穩定物質，通過自己重復檢測得到這種物質在儀器檢測系統上的一個檢測值，然后通過統計方法建立質控范圍，用來監控室內精密度的質控方法。標本采集和核酸提取是PCR檢測流程中最重要的兩步,每一步都應有相應的質量控制措施。在開展質控前,每位工作人員要對質控的重要性、基礎知識、一般方法有充分的了解，并在質控的實際工作中進行不斷提高。因此，室內質控要求實驗人員做好記錄，持之以恒，不斷總結提升。

3.2室間質量管理室間質控就是用一種穩定物質，分發到各個實驗室，每個實驗室分別用各自的儀器檢測該物質，得到一組檢測值，用統計方法得到該物質的檢測值可接受范圍，用來評判檢測系統是否與其他檢測系統結果一致的質控方法。因此，為了出具的報告結果可信，參加室間質控也非常重要。對于在室間質控中出現的問題，要認真的分析原因，找出問題所在，針對問題進行改進,通過不斷的學習總結檢驗水平才會提高。

4小結

隨著PCR技術的不斷成熟發展，它在臨床實驗室中的運用也越來越多，給臨床醫生對疾病的診斷治療提供了很大的幫助。但由于PCR技術的特殊性，想要開展PCR實驗室就必須嚴格按照要求建立和管理。只要能按照PCR實驗室的標準建立實驗室，采取標準化的的管理,就可以保證操作的安全性和結果的可靠性，就可以為臨床提供有價值的數據。

參考文獻

[1]朱忠勇．實用醫學檢驗學[M]．2版．北京：人民軍醫出版社，1997：1041．

[2]宋秀軍，江其生．淺談臨床定量PCR實驗室管理[J]．醫療衛生裝備，2010，31(2)：84-84．

[3]梁志東．PCR實驗室污染的排除[J]．實用醫技雜志，2006，13(7)：1141-1142．

[4]江其生，金濟民，李峰生，等．單流向一體化臨床定量PCR實驗室的優化設計與設備配置[J]．醫療衛生裝備，2006，27(9)：34-35．

[5]楊永蘭，林云．淺談臨床PCR實驗室的建立和管理[J]．中國衛生標準管理，2014，5(6)：119-120．

[6]孟慶輝，唐桂華，任自力．淺談PCR實驗室建設過程中的關鍵控制點[J]．中外健康文摘，2011，8(40)：113-114．

(收稿日期：2015-12-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.067

文獻標識碼：B

文章編號：1673-4130(2016)05-0714-03

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