MAPKs在丙泊酚后處理減輕大鼠缺血/再灌注損傷中作用①

王　坤,陳琪珍,楊劍波,鄂蘇評

(哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院麻醉科，黑龍江 哈爾濱 150081)

?

MAPKs在丙泊酚后處理減輕大鼠缺血/再灌注損傷中作用①

王坤,陳琪珍,楊劍波,鄂蘇評

(哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院麻醉科，黑龍江 哈爾濱 150081)

摘要:目的:研究丙泊酚后處理對離體大鼠缺血/再灌注心肌的影響及MAPKs信號轉導通路在其中的作用。方法 ：選用SD大鼠40只，按照隨機數字表法分為5組：空白對照組(Control組，n=8)、缺血/再灌注組(I/R組，n=8)、丙泊酚后處理低劑量組(Plow組，n=8)、中劑量組(Pmid組，n=8)和高劑量組(Phigh組，n=8)；采用Langendorff 離體心肌缺血再灌注法建立模型，于續灌末取下心臟，采用Tunel 法檢測缺血區心肌細胞凋亡和Western blot 測定Bcl-2、Bax及MAPKs信號轉導通路的蛋白表達。結果:與Control組比較，I/R組心肌細胞凋亡率(AR)顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌細胞AR顯著較少(P<0.05)；與Control組比較，I/R組心肌Bcl-2表達顯著降低(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織Bcl-2表達明顯增加(P<0.05)；與Control組比較，I/R組心肌Bax表達顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織Bax表達顯著較少(P<0.05)；與Control組比較，I/R組心肌組織p-ERK1/2表達顯著降低(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織p-ERK1/2表達明顯增加(P<0.05)；與Control組比較，I/R組心肌組織p-p38表達顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織p-p38表達顯著較少(P<0.05)。結論：丙泊酚后處理減少離體大鼠缺血/再灌注心肌細胞的凋亡，發揮心肌保護作用，其保護機制與激活MAPKs信號轉導通路(ERK1/2和p38活化)有關。

關鍵詞:MAPKs；丙泊酚后處理；缺血/再灌注；Bcl-2；Bax

急性心肌缺血事件是臨床上麻醉醫生經常面臨的一種病理生理改變，是圍術期嚴重的心臟危險事件，也是圍術期死亡常見原因。適時進行有效再灌注是挽救心肌最有效的方法。但再灌注也加重心肌損傷，即缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)。因此，尋找一種臨床可控性強，又能切實有效的減輕再灌注損傷的防治措施已成為一項重要的基礎和臨床課題。在我國，靜脈麻醉藥丙泊酚使用較為普遍。丙泊酚屬于新型非巴比妥類靜脈全麻藥，起效迅速，作用腦部GABA受體—氯離子復合物，發揮鎮靜催眠作用，效果安全可靠。目前在臨床麻醉工作中應用廣泛。以往研究證實，預先應用丙泊酚于缺血性心肌可以起到心肌保護作用，在離體實驗中，預先應用丙泊酚灌注離體心肌，發現丙泊酚可以明顯減輕缺血/再灌注心肌的水腫，發揮心肌保護作用。但有關丙泊酚后處理的心肌保護作用及該保護作用是否通過MAPKs信號轉導通路，目前尚不十分清楚。因此深入研究丙泊酚后處理對心肌缺血/再灌注損傷的影響及其作用機制更具現實意義。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組

選用健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級，體重(200±20)g，16～18月齡，購于北京維通利華公司實驗動物中心。在溫度(23±0.5)℃，濕度為40%~60%，光照與熄燈各12h環境中適應性馴養7d，操作均由固定人員在上午8：00至10：00進行實驗。動物的處理符合哈爾濱醫科大學實驗動物管理規定和國際實驗動物使用準則。

選用SD大鼠40只，按照隨機數字表法分為為5組：空白對照組(Control組，n=8)，離體心臟在37°C條件下，平衡30min，正常K-H液灌流210min；缺血/再灌注組(I/R組，n=8)，離體心臟在37°C條件下，平衡30min，全心缺血30min，再灌注180min；丙泊酚后處理低劑量組(Plow組，n=8)、中劑量組(Pmid組，n=8)和高劑量組(Phigh組，n=8)，離體心臟穩定30min，全心缺血30min，丙泊酚低劑量(60umol·mL-1)、中劑量(100umol·mL-1)和高劑量(150umol·mL-1)的K-H灌注溶液處理2min，洗脫2min，連續3個循環后，再灌注168min。

1.2離體大鼠心臟灌注langendorff模型

所有大鼠禁食12h，可以自由飲水。麻醉采用20%烏來糖(腹腔注射1.0g·kg-1)，進入麻醉狀態后，利多卡因1.0%腹前壁切口處局部侵潤麻醉。然后仰臥位并固定四肢，備皮后消毒，再橫向沿肋緣剪開腹前壁，剪開腹中線向上至劍突，向下剪至膈肌，再縱向沿兩側鎖骨中線剪開胸腔，逐層分離縱膈前組織，將胸壁前組織翻向頭側，顯露出心臟，輕柔取出心臟后，立即放于4℃的飽和的K-H緩沖液(用混合氣體95%O2+5%CO2，1.5L·min-1飽和)中反復漂洗，沖出心臟內殘余血液。使用眼科鑷子提起主動脈進行插管，連接Langendorff灌注管口，逆行采用恒壓灌注，保持灌注壓10kPa，速度維持在7～10mL·min-1。灌注系統和心肌組織溫度維持在(37±0.5)℃，室溫保持在(25±1)℃。開始灌流數秒后心臟便開始跳動。1min后剪開左心耳上方，經過左心房和二尖瓣，將一頭帶有測壓導管的心室球囊送至左心室，另一端經過壓力換能裝置連接到生理記錄儀上。穩定后10min后，使用1mL注射器緩慢向左心室球囊內注射生理鹽水(40~60μL)，然后調節左水囊容積使左心室舒張末期壓力(LVEDP)保持在3~7mmHg范圍內，然后維持水囊容積恒定。

選擇離體心臟標準：經Langendorff模型平衡灌注15min后，離體心臟HR<200bpm，LVSP<10 kPa，室早或房早>2bpm均排除實驗。

1.3指標檢測

采用Tunel 法檢測缺血區心肌細胞凋亡和Western blot 測定Bcl-2、Bax及MAPKs信號轉導通路的蛋白表達。

1.3.1Tunel法檢測心肌細胞凋亡

取同一部位心肌組織做石蠟切片，鏡下選取3個高倍鏡(×200)視野，分別計數凋亡細胞數和細胞總數(棕色核染色即是凋亡細胞)，以凋亡率(Apoptotic Rate，AR)作為心肌細胞凋亡指標：AR =凋亡細胞數/心肌細胞總數×100%。

1.3.2Western blot 測定心肌組織Bcl-2、Bax及MAPKs蛋白表達

取同一部位心肌組織，研磨后勻漿提取總蛋白，采用BCA方法檢測蛋白質濃度。采用loading buffer進行沸水浴，5~10min經過充分變性，加各組心肌組織蛋白40μg，進行聚丙酰胺凝膠電泳，電泳條件恒流250mA。采用濕法進行轉膜60 min，到PVDF膜，含5%脫脂奶粉的 TBST 溶液中進行封閉，封閉約60min，然后4℃條件下一抗(1:500)過夜，采用TBST溶液洗膜10min×3次，在37℃條件下使用辣根過氧化物酶標記的二抗(1:1 000)進行孵育90min，TBST洗膜10 min×3次，選用ECL試劑盒進行發光，最后曝光。目標蛋白(Bcl-2、Bax和total-ERK1/2、total-p38、total-JNK及p-ERK1/2、p-p38、p-JNK)條帶與GADPH比值表示其相對表達量。

1.4統計學方法

采用 SPSS 13. 0 的統計學軟件包進行統計學處理。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1心肌細胞凋亡率比較

與Control組比較，I/R組心肌細胞AR(5.93%)顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌細胞AR(3.11%)顯著較少(P<0.05)，Plow和Phigh組心肌細胞AR(5.52%和5.24%)無明顯減少，見圖 1。

2.2心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達比較

與Control組比較，I/R組心肌組織Bcl-2表達顯著降低(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織Bcl-2表達明顯增加(P<0.05)，Plow組和Phigh組心肌組織Bcl-2表達無明顯增加， 見圖 2。

與Control組比較，I/R組心肌組織Bax表達顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織Bcl-2表達明顯降低(P<0.05)，Plow組和Phigh組心肌組織Bax表達無明顯降低， 見圖 2。

圖1心肌細胞凋亡率表達(×200)

圖2　心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達

2.3心肌組織MAPKs信號轉導通路蛋白表達比較

與Control組比較，I/R組心肌組織p-ERK1/2表達顯著降低(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織p-ERK1/2表達明顯增加(P<0.05)，Plow組和Phigh組心肌組織p-ERK1/2表達無明顯增加，見圖3。

與Control組比較，I/R組心肌組織p-p38表達顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pmid組心肌組織p-p38表達明顯降低(P<0.05)，Plow組和Phigh組心肌組織p-p38表達無明顯降低，見圖3。

各組間total-ERK1/2、total-p38、total-JNK及p-JNK蛋白表達無明顯差異。

圖3　心肌組織MAPKs信號轉導通路蛋白表達

3討論

本研究發現，中劑量丙泊酚后處理能顯著減少離體大鼠缺血/再灌注心肌組織細胞凋亡，發揮心肌保護作用，該保護作用可能是通過MAPKs信號轉導通路(ERK1/2和p38)活化來實現的。

缺血/再灌注損傷所致心肌細胞凋亡是心肌損傷的重要原因。Bcl-2和Bax是依賴線粒體凋亡途徑中重要的一組調控基因。Bcl-2是調控細胞凋亡的重要基因，其表達蛋白位于線粒體膜或核膜及溶酶體膜，可抑制細胞凋亡[1]。Bax也屬Bcl-2基因家族，但功能與Bcl-2基因相反，Bcl-2有抗凋亡功能，而Bax則有促凋亡作用[2]。Bax與Bcl-2蛋白形成異二聚體，使Bcl-2蛋白失活，從而促進細胞凋亡。Bcl-2和Bax相互作用，共同調控細胞凋亡[3,4]。本實驗結果顯示：I/R組抗凋亡Bcl-2表達下降，促凋亡Bax表達上調，說明缺血/再灌注損傷促進凋亡基因Bax表達，而抗凋亡基因Bcl-2表達受到抑制，從而誘導心肌細胞凋亡形成，這與心肌組織形態學檢查結果表達一致。

目前丙泊酚是我們臨床最常用的新型非巴比妥類的靜脈全麻藥，作用于腦內GABA受體—氯離子復合物，使其激活發揮鎮靜催眠效果，能夠抑制脂質過氧化反應、改善心肌細胞線粒體膜通透性等效果[5]。以往研究證實，丙泊酚可以清除體內自由基、增加機體抗氧化水平，顯著抑制心肌細胞肌纖維跨膜鈣離子的內流，然后抑制心肌細胞鈣超載，可以發揮一定的心肌保護效應。本研究結果顯示，丙泊酚中劑量組與缺血/再灌注組比較，Bcl-2表達上調，Bax表達下調，說明丙泊酚通過增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制促凋亡蛋白Bax表達，對減輕心肌缺血/再灌注損傷，這與以往研究結果相一致。

目前有關丙泊酚后處理心肌保護作用的信號轉導機制尚不十分清楚。細胞凋亡是缺血/再灌注過程中心肌細胞死亡的重要形成機制，其凋亡的發生、發展受絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路(mitogen- activated protein kinase，MAPKs)的調控。該家族主要包括：①細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinases，ERK1/2)；②蛋白激酶p38(p38)；③c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)。這3條主要信號轉導途徑在心肌缺血/再灌注中發揮的作用不盡相同：ERK1/2在心肌缺血/再灌注時激活可以起到保護心肌細胞的作用，阻斷ERK1/2通路可增加心肌細胞的凋亡[6]；而JNK和p38通路激活后可使細胞凋亡增加[7]。那么丙泊酚心肌保護效應是否與ERK1/2、 JNK和p38活化有關呢？目前有關MAPKs途徑在丙泊酚心肌保護效應中作用的報道較少，且未形成統一觀點。以往研究提示在心肌再灌注時激活ERK1/2途徑可發揮心肌保護作用[8,9]。Sun[10]等采用乳鼠的心肌細胞缺氧/復氧模型進行實驗，結果發現，缺氧后處理抑制缺氧/復氧誘導JNK和p38 MAPK磷酸化，可減少Bax和凋亡細胞數目，提示抑制JNK和p38可減輕缺氧/再灌注所致細胞凋亡。在本研究中，丙泊酚的劑量我們參照文獻[10,11]選取。本實驗結果顯示，中劑量丙泊酚可增加心肌ERK1/2活性，降低p-38表達，說明丙泊酚可能通過ERK1/2和p-38信號轉導通路減輕心肌缺血/再灌注損傷，該結果與文獻[12]相似，證實丙泊酚后處理在離體大鼠心肌缺血/再灌注過程中具有心肌保護作用。

綜上所述，丙泊酚對離體大鼠缺血/再灌注心肌有保護作用，可減少心肌細胞凋亡，其信號轉導機制可能與ERK1/2和p38信號通路活化有關。

參考文獻：

[1]Duan X, Ji B, Yu K. Acidic buffer or plus cyclosporine A postconditioning protects isolated rat hearts against ischemia-reperfusion injury[J].Perfusion,2011,26(3):245-252

[2]Loor G, Kondapalli J, Iwase H, et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion[J]. Biochim Biophys Acta,2011,1813(7):1382-1394

[3]Hochhauser E, Kivity S, Offen D, et al. Bax ablation protects against myocardial ischemia-reperfusion injury in transgenic mice[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008,284(6): 2351-2359

[4]Moe GW, Naik G, Konig A, et al. Early and persistent activation of myocardial apoptosis, bax and caspases: Insights into mechanisms of progression of heart failure[J]. Pathophysiology, 2008,(3):183-192

[5]Shao H, Li J, Zhou Y, et al. Dose-dependent protective effect of propofol against mitochondrial dysfunction in ischaemic/reperfused rat heart: role of cardiolipin[J]. Br J Pharmacol,2008,153(8):1641-1649

[6]Li DY, Tao L, Liu H, et al. Role of ERK1/2 in the anti-apoptotic and cardioprotective effects of nitric oxide after myocardial ischemia and reperfusion[J]. Apoptosis,2006,11(6):923-930

[7]Pantos C, Malliopoulou V, Paizis I, et al. Thyroid hormone and cardioprotection: study of p38 MAPK and JNKs during ischaemia and at reperfusion in isolated rat heart[J]. Mol Cell Biochem,2009, 242(1-2):173-180

[8]Yang XM, Proctor JB, Cui L, et al. Multiple, brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways[J]. J Am Coll Cardiol,2004,44(5):1103-1110

[9]Darling CE, Jiang R, Maynard M,et al. Postconditioning via stuttering reperfusion limits myocardial infarct size in rabbit hearts: role of ERK1/2[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,289(4):1618-1626

[10]Sun HY, Wang NP, Halkos M, et al. Postconditioning attenuates cardiomyocyte apoptosis via inhibition of JNK and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways[J]. Apoptosis,2006,11(9):1583-1593

[11]Shao H, Li J, Zhou Y. Dose-dependent protective effect of propofol against mitochondrial dysfunction in ischaemic/reperfused rat heart: role of cardiolipin[J]. Br J Pharmacol,2008,153(8): 1641-1649

[12]He W, Zhang F J, Wang S P. Postconditioning of sevoflurane and propofol is associated with mitochondrial permeability transition pore[J]. J Zhejiang Univ Sci B,2008,9(2):100-108

(收稿日期：2015-12-05)

中圖分類號：R542.2

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0008-03

作者簡介：王坤(1979~)女，黑龍江哈爾濱人，博士，副教授，研究方向：心肌保護作用機制研究。

基金項目：黑龍江省教育廳2012年度科學技術研究(面上)計劃項目，編號：12521189。