云南省西雙版納勐?？h學齡前兒童地貧調查及基因單倍型分析

[摘要]目的：對西雙版納州勐?？h學齡前兒童進行地中海貧血的流行病學調查和基因單倍型分析。方法：勐海縣婦幼保健院體檢的兒童應用血紅蛋白電泳聯合血常規篩查地貧，同時對所有病例進行α-地貧、β-地貧基因檢測.應用連鎖分析和限制性內切酶片段長度多態性方法分析當地地貧人群的基因單倍型。結果：在103名受檢的學齡前兒童中，確診α-地貧者14例，β地貧9例，α-地貧復合β-地貧2例， α-地貧基因攜帶率15.5%，β-地貧基因攜帶率12.6%。檢出5種與地貧相關的基因單倍型。結論：西雙版納州勐?？h是地貧高發地區，研究結果有助于當地地貧防控有效開展.

[關鍵詞]地中海貧血：云南??；基因單倍型

地中海貧血是我國南方各省影響最大、發病率最高的遺傳病之一，多見于廣東、廣西、云南、海南等省。重型地貧患兒需要終生輸血治療，常因慢性溶血性貧血和鐵離子負荷，導致肝脾腫大、心肌損害，最終治療無效死亡。中間型地貧患者也會因持續的慢性溶血性貧血而出現生長發育遲緩、體能低于正常人。輕型地中海貧血可無臨床癥狀，極易被漏診、誤診。世居于云南省內，人口超過百萬的少數民族如傣族、壯族已經被報道是地貧高發的民族。不同民族地貧類型構成比以及發病情況有較大區別，對地貧高發地區進行流行病學研究有助于地貧防控的有效開展，但目前為止尚無明確系統的研究了解云南省兒童地貧狀況特別是少數民族中血紅蛋白病的流行狀況。本文報道西雙版納勐?？h婦幼保健院2013年2月至2013年7月期間，對103例兒童進行地貧篩查及地貧家系研究的臨床研究結果。

1資料和方法

1.1資料來源

研究對象為2013年2月-2013年7月在云南省西雙版納州勐?？h婦幼保健院進行體檢的6月-6歲兒童103人，同時對患者進行血常規、血紅蛋白電泳篩查以及地貧基因診斷，同時登記登記受檢者的姓名、編號、民族、籍貫、年齡等信息，血紅蛋白電泳、血常規資料和基因診斷結果輸入Excel軟件數據庫中保存。

1.2方法

1.2.1血紅蛋白電泳篩查

受檢者進行檢查時抽取受檢兒童靜脈血2ml，EDTA抗凝，4-8℃冷藏保存1-5天內檢測。采用血紅蛋白電泳法定量檢測各血紅蛋白成份的比例，分析異常血紅蛋白區帶。

1.2.2血常規檢測

用貝克曼LH750型全自動血液分析儀進行檢測，主要觀察的參數：平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細胞體積（MCV）、紅細胞血紅蛋白量（Hb）、紅細胞體積分布寬度（RDW）以及平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）。α-地貧分子篩查的血液學指標是：MCV<80fL，MCH<27Pg，HbA2<2.5%；β-地貧進行分子篩查的血液學指標是：①MCV<80 H，MCH<27pg和HbA2>3.5%；②表現出HbE電泳帶或者其它異常條帶；③HbF>5.0%。

1.2.3地貧基因診斷

α-或β-珠蛋白基因常見突變檢測：使用深圳亞能生物技術有限公司生產的地貧基因診斷試劑盒，采用PCR-反向斑點雜交法（PCR-reversed dot blotting，PCR-RDB），檢測中國人群。β-珠蛋白基因常見17個位點的18種突變；采用多重PCR法檢測。一珠蛋白基因常見的3種缺失：-SEA（東南亞缺失型）、-α3.7（右缺失型）、-α4.2（左缺失型）。

1.2.4珠蛋白基因單倍型分析

對9例本次確診。一地貧和以往收集的7例確診β-地貧的家系，進行β-珠蛋白基因單倍型的研究。采用基于PCR的RFLP技術和家系連鎖分析方法確定先證者兩條β-地貧染色體的單倍型，選擇的7個RFLP位點分別是：Hind Ⅱ-5′ε，HindⅢ-Cγ，Hind Ⅲ Aγ，Hind Ⅱ-ψβ，HincⅡ-3′ψβ，AvaⅢ-β，BamHI-3′β。引物、實驗條件以及單倍型命名原則參見文獻。

2結果

2.1地貧基因診斷結果

對103例兒童進行血常規聯合血紅蛋白電泳篩查；根據篩查結果，α-地貧篩查陽性病例進行3種缺失型。α-地貧的檢測，β-地貧篩查陽性病例進行18種常見β-地貧的檢測以及3種缺失型。α-地貧的檢測。共檢出14例。α-地貧，9例β-地貧（2例為重癥β-地貧患兒），2例α-地貧合并β-地貧（-α3.7合并CD17型1例，-α4.2合并CD26型1例）。α-地貧的基因攜帶率是15.53%（16/103），β-地貧的基因攜帶率是12.62%（13/103）。

2.2基因單倍型分析結果

使用連鎖分析和RFLP技術分析共16例確診β-地貧的家系的基因單倍型，其中有7個家系未能提供連鎖信息，不能檢測出基因單倍型類型。9例確診。β-地貧的家系中，發現CD41-42突變類型有三種相關的基因單倍型類型（Ⅶ、Ⅴ、Ⅰ），CD17突變類型的基因單倍型為Ⅶ，CD26突變類型的基因單倍型為Ⅲ、CD27/28突變類型的基因單倍型為Ⅳ。共發現5種與β-地貧相關的基因單倍型類型，其中以類型Ⅶ最為多見。

3討論

血紅蛋白電泳聯合血常規在地中海貧血篩查過程中起非常重要的作用，其能夠定量檢測各種血紅蛋白水平，并將地中海貧血初步分為α-型和β-型，為進一步進行基因診斷和遺傳咨詢提供基礎。血液學篩查對靜止型地中海貧血患者存在漏診風險，且年齡小于1歲兒童，血液中HbF水平較高會對篩查產生干擾。對于α-地貧合并β-地貧的情況，血紅蛋白電泳多顯示為HbA2的明顯升高，臨床上對疑似β-地貧的患者，需要加做α-地貧的基因診斷（研究中檢出2例α-地貧合并β-地貧的病例）。此外，兒童及嬰幼兒不宜多次反復抽血。綜合以上幾點原因，我們在研究人群中一次抽取靜脈血2ml，直接進行血紅蛋白電泳聯合血常規篩查以及常見。α-、β-地貧的基因診斷，以高效準確的提高檢出率。

本調查表明，勐海縣送檢兒童α-地貧的檢出率是15.53%，β-地貧的檢出率是12.62%，西雙版納勐海屬于地貧高發地區，受檢兒童中有2例為重癥。地貧患兒，高達近2%。這樣地貧高發的情況與相鄰地區泰國的傣族人群地貧發病率相似。西雙版納地貧的單倍型顯示出多種類型，提示這些地方的民族可能有多次的遺傳交流，顯示出豐富的基因多態性。在本地區地貧高發這一背景下，進行地貧篩查并對高危人群以及基層醫務人員宣傳是有重要意義的，有望減少重型地貧兒的出生率，降低圍生兒病死率，提高人口健康素質。地貧貧血的血常規為小細胞低色素性，與小兒缺鐵性貧血有著共同點。后者補鐵是主要的治療措施，但地貧患兒由于體內鐵沉積不能補鐵。在地貧高發地區進行輕型地貧篩查，能提高當地地貧防控意識，可為嬰幼兒期貧血的診斷及鑒別診斷提供實驗室依據，并提升醫務人員對疾病認識的水平，避免不必要的漏診、誤診和錯誤治療。

本研究在國內首次對西雙版納州少數民族地區兒童進行了地貧流行病學的調查研究，為今后進一步地貧防控與疾病認識提供了科學依據.但本研究樣本量較小僅103人，當地人種來源復雜，且就診兒童會存在選擇偏倚，一部分學齡前兒童父母由于認識不到位等原因放棄體檢，若真實了解西雙版納地區兒童地貧發病率，還需要進行分層次大樣本的流行病學研究。西雙版納地區地貧廣泛存在也有必要進一步推廣在人群中地貧攜帶者篩查，對攜帶者夫婦提供遺傳咨詢和產前基因診斷服務，提高出生人口素質，促進民族團結，避免重癥地貧患兒出生。