負載姜黃素的玉米醇溶蛋白-多糖納米顆粒的制備及生物活性研究

黃旭琳，黃曉霞，鐘南京，高永清，胡坤

(廣東藥科大學 1.公共衛生學院，廣東 廣州 510310； 2.食品科學學院，廣東 中山 528458)

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藥劑學

負載姜黃素的玉米醇溶蛋白-多糖納米顆粒的制備及生物活性研究

黃旭琳1，黃曉霞1，鐘南京2，高永清2，胡坤2

(廣東藥科大學 1.公共衛生學院，廣東 廣州 510310； 2.食品科學學院，廣東 中山 528458)

目的 制備負載姜黃素的玉米醇溶蛋白-多糖納米顆粒及評價其生物活性。方法 以反溶劑法和靜電沉積法制備負載姜黃素的核/殼型復合納米顆粒，以掃描電鏡觀察形貌，DPPH·法測定抗氧化活性，平板抑菌試驗測定抗菌活性，模擬體外消化試驗測定消化吸收率。結果 納米顆粒為表面光滑的球形，平均粒徑為133 nm；姜黃素納米顆粒對DPPH·自由基的清除率明顯高于姜黃素乙醇溶液，清除率分別為(13.89±0.69)、(16.73±0.097) μg/mL；納米顆粒的抑菌效果較差；納米顆粒包埋的姜黃素消化吸收率提高了4倍。結論 納米顆粒包埋的姜黃素具有較高的抗氧化活性及消化吸收率，在功能性食品及藥物方面有良好的應用前景。

姜黃素； 玉米醇溶蛋白； 多糖； 納米顆粒； 抗氧化活性

姜黃素是存在于姜黃(Curcumalonga)根莖中的一種天然脂溶性多酚，是我國傳統中藥姜黃的主要活性成分。研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗感染、抗菌、抗病毒、抗風濕病、神經保護、抑制癌細胞增殖等多種藥理活性[1-4]。雖然姜黃素具有多種有益健康的效應，但在藥物和營養補充劑方面的應用卻非常有限，這主要是因為姜黃素幾乎不溶于水，口服姜黃素的生物利用度非常低[2]。

利用玉米醇溶蛋白制備負載姜黃素的納米顆粒，以提高姜黃素在水中的分散性及生物活性逐漸受到重視[5-6]。玉米醇溶蛋白是玉米的主要儲存蛋白，因其疏水性氨基酸含量高，可溶于50%～90%的乙醇溶液而不溶于水[7]。采用反溶劑法制備的納米顆粒易因玉米醇溶蛋白的疏水相互作用而產生聚集[6]。本課題組利用靜電沉積法，將果膠吸附到納米顆粒表面，利用果膠羧基基團的靜電排斥穩定納米顆粒，制得的納米顆粒具有較好的水分散性[8]，而用海藻酸鈉替代部分果膠，可以提高納米顆粒在中性pH的水相中的分散性[9]。本文用海藻酸鈉替代部分果膠，制備負載姜黃素的玉米醇溶蛋白-多糖復合納米顆粒，研究納米顆粒包埋的姜黃素清除自由基能力及抗菌活性，并以模擬消化液研究姜黃素的生物利用度，以期開發出具有商業應用價值的姜黃素納米載體系統。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白(醫藥級，上海撫生實業有限公司)；姜黃素(質量分數>98%，Acros Organics)；果膠(橘皮果膠)、胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽鹽、Tween 80、維生素C(美國Sigma-Alorich)；海藻酸鈉(食品級，青島明月海藻有限公司)；1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH，日本Tokyo Chemical Industry)；HCl、NaOH、無水乙醇、二甲基亞砜、三氯甲烷等都為分析純。

大腸埃希菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由廣東省微生物菌種保藏中心提供；營養瓊脂、營養肉湯(廣東環凱微生物科技有限公司)。

1.2 儀器

R05磁力攪拌器(瑞士IKA)；pH-3C pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；R-1001N旋蒸蒸發儀(鄭州長城科工貿有限公司)；Nano-ZS激光粒度儀(英國Malvern)；NovaNanoSEM 430場發射掃描電鏡(荷蘭FEI)；TU-1901紫外可見分光光度計(北京譜析通用儀器有限公司)。

1.3 負載姜黃素的玉米醇溶蛋白/果膠納米顆粒的制備

參照文獻[8]方法，預先配制含玉米醇溶蛋白(質量濃度2.0%)和姜黃素(質量濃度0.24%)的乙醇溶液(體積分數85%)、質量濃度為0.2%的果膠和海藻酸鈉溶液，將果膠和海藻酸鈉溶液按照7∶3的體積比混合，用HCl調節至pH 4.0。

用注射器將4.0 mL姜黃素-醇溶蛋白溶液緩慢分散至16 mL pH 4.0蒸餾水(0.1 mol/L HCl溶液調節)中，分散時以磁力攪拌(1 000 r/min，3 min)，旋轉蒸發乙醇，并用pH 4.0的蒸餾水補充到20 mL。將制得的分散液注入到25 mL果膠/海藻酸鈉多糖溶液中，分散時磁力攪拌(900 r/min，5 min)，得到含姜黃素-醇溶蛋白-果膠/海藻酸鈉納米顆粒分散液，調節至pH 4.0，離心(3 000 r/min，10 min)除去大顆粒即為所需的樣品。以動態激光散射法測定顆粒的粒徑分布。

1.4 納米顆粒中姜黃素質量分數的測定[8]

取冷凍干燥后的納米顆粒10 mg，溶于10 mL DMSO中，避光，磁力攪拌2 h(500 r/min)，離心(5 ℃,12 000 r/min)1 h，取上清液以DMSO稀釋10倍，在433 nm處測定吸光度。同波長下測定不同濃度的姜黃素-DMSO溶液的吸光度，并繪制標準曲線(y=0.15x-0.002，R2=0.996 8，n=6)。通過標準曲線可算出納米顆粒中姜黃素的質量分數。

1.5 納米顆粒的掃描電鏡(SEM)觀察

取少量納米顆粒黏附于導電膠上，噴金(15 nm)后在場發射掃面電鏡下觀察，高真空模式，10 kV加速電壓，放大倍率×100 000。

1.6 DPPH·自由基清除試驗

[10]的方法，并做以下修改：將冷凍干燥的納米顆粒(溶于去離子水)、姜黃素標準品(乙醇溶解)配制成不同的濃度。然后將100 μmol/L DPPH·乙醇溶液2 mL分別與等體積的納米顆粒分散液和姜黃素乙醇溶液混合，在室溫下避光保存30 min，測量反應溶液的吸光度(571 nm)。達到50%清除率的樣品濃度(SC50)用于比較不同樣品的自由基清除能力。同時做未負載姜黃素的納米顆粒的對照試驗，以消除玉米醇溶蛋白和多糖的影響。按以下公式計算自由基清除活性：

式中：As和Ac分別是樣品和空白的吸光度。

1.7 納米顆粒抗菌能力的測定

將大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌菌株分別接種營養肉湯培養基(pH 7.4)，稀釋至106CFU/mL備用[11]。將冷凍干燥的納米顆粒溶于雙蒸水中制備姜黃素質量濃度分別為240、180、120、60 μg/mL的分散液。往培養皿中加入無菌熔融營養瓊脂15～20 mL及106CFU的待測細菌懸液1 mL，待瓊脂凝固后進行打孔(d=7 mm)。向孔穴中加入納米顆粒膠體分散液100 μL，在4 ℃條件下靜置4 h，再放置于37 ℃恒溫箱培養24 h后測量抑菌圈直徑。對照組用等量的姜黃素的DMSO溶液。

1.8 納米顆粒體外模擬消化吸收能力的測定[12]

1.8.1 模擬胃液消化階段 準確稱取0.1 g冷凍干燥的納米顆粒(姜黃素質量分數9.52%)或與納米顆粒組分相同的姜黃素、玉米醇溶蛋白和果膠混合物分散在20 mL雙蒸水中，磁力攪拌器攪拌分散1 h(500 r/min)，然后加入到20 mL模擬胃液中(含0.064 g胃蛋白酶，質量分數0.2%NaCl，質量分數0.05% Tween 80，鹽酸調節pH至1.2)，將混合液調整到pH 2.5，在37 ℃恒溫搖床保溫消化2 h，然后以NaOH溶液調節pH 6.8，終止消化。1.8.2 模擬小腸消化階段 將胃液消化液置于37 ℃水浴中，依次加入37 ℃預熱的膽鹽溶液(質量濃度為4.7%)4.0 mL、CaCl2溶液(質量濃度11%)1 mL及胰酶液(質量濃度5.8%)2.5 mL，以恒定pH滴定儀保持體系pH 7.0。加入胰酶液后開始計時，消化時間2 h。

1.8.3 消化液中姜黃素的定量分析 將最終的消化液離心分離(12 000 r/min，30 min)，收集上清液并記錄體積。取上清液4.0 mL，加入三氯甲烷4.0 mL，渦旋混合2 min，離心分離，取三氯甲烷層。水層再用三氯甲烷4.0 mL提取1次，離心分離后合并三氯甲烷層。在417 nm波長下測定吸光度。同波長下測定不同濃度的姜黃素-三氯甲烷溶液吸光度，并繪制標準曲線(y=0.125 4x-0.001 6，R2=0.999 9，n=6)。通過下式計算姜黃素的消化吸收率：

式中：Ccur指離心后上清液中姜黃素濃度；Vsur指上清液體積；mcur指納米顆粒中姜黃素的質量。

1.9 數據處理

2 結果與分析

2.1 納米顆粒形貌特性

激光動態光散射測得的負載姜黃素納米顆粒的粒徑分布見圖1A。可見，絕大多數顆粒分布在100～200 nm范圍，同時也存在少量的粒徑小于100 nm的顆粒。顆粒的平均粒徑為133 nm，多分散性指數(PDI)為0.22，說明制備的納米顆粒粒徑均勻。納米顆粒的微觀形貌見圖1B。可見，納米顆粒呈球形，表面光滑，大多數粒徑在100～200 nm，與動態光散射法測得的數據一致，經測定冷凍干燥后的納米顆粒的再分散性，結果表明分散的納米顆粒溶液為澄清透明狀，無肉眼可見大顆粒，使用動態光散射測得的納米顆粒的平均粒徑較新鮮制備的納米膠體溶液的平均粒徑稍大。冷凍干燥后的納米顆粒產率為(87.86±2.77)%，包封率為(92.9±4.8)%，載藥量為(6.2±0.23)%。

121086420強度/%D/nm1000100101BA

2.2 DPPH自由基清除能力

姜黃素具有較強的清除DPPH自由基能力，但在水中溶解度極低，將姜黃素溶解在乙醇溶液中，能發揮其清除自由基能力。從圖2可見，姜黃素乙醇溶液、姜黃素納米顆粒和維生素C對DPPH·的清除能力呈現劑量依賴型增長，而無姜黃素的納米顆粒清除自由基的能力極低，且無劑量依存關系。維生素C的自由基清除活性最強，在質量濃度為10 μg/mL時，自由基清除能力已達到90%。當姜黃素質量濃度高于5 μg/mL時，納米顆粒負載的姜黃素比姜黃素乙醇溶液表現出更強的自由基清除能力，且隨著姜黃素質量濃度的增加，近似線性的增加。而乙醇溶解的姜黃素在質量濃度超過20 μg/mL時，清除自由基能力隨濃度的增加增幅下降。姜黃素乙醇溶液、納米顆粒和維生素C的SC50分別為(16.73±0.097)、(13.89±0.69)、(5.04±0.62) μg/mL，3者之間差異有統計學意義(P<0.05)，說明包埋后的姜黃素比乙醇溶解的姜黃素具有更強的清除DPPH自由基能力。

100806040200自由基抵制率/%姜黃素納米顆粒姜黃素比乙醇溶液維生素C101520253005ρ/(μg?mL-1)

圖2 姜黃素對DPPH自由基的清除能力
Figure 2 DPPH radical scavenging activity of curcumin

2.3 姜黃素納米顆粒的抗菌能力

平板抑菌圈試驗測定納米顆粒負載的姜黃素對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌革蘭陰性菌(G-)和金黃色葡萄球菌(G+)生長抑制的能力，結果見表1及圖3。可見，納米顆粒負載的姜黃素基本沒有抑菌能力；而姜黃素/DMSO溶液則具有顯著的抑菌效果，最低濃度為60 μg/mL時，對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌都有明顯的抑制作用，抑菌環直徑分別為(13.0±2.1)、(13.0±0.7)、(14.8±0.8) mm，隨著姜黃素濃度增加至240 μg/mL，姜黃素的抑菌效果與劑量之間沒有明顯的正相關性(P>0.05)，如銅綠假單胞菌培養基中，當姜黃素濃度增加到180 μg/mL，抑菌環直徑為(16.5±3.35) mm，而濃度為240 μg/mL時，抑菌環直徑為(13.5±2.1) mm。

注：左上角和左下角為姜黃素-DMSO溶液；右上角和右下角為包埋的姜黃素膠體分散液。

圖3 姜黃素納米顆粒對大腸埃希菌的平板抑菌環

Figure 3 Antimicrobial ring ofE.coliof curcumin loaded zein/polysaccharide nanoparticles

2.4 姜黃素納米顆粒體外消化吸收率

以模擬胃腸消化液體外消化負載姜黃素的納米顆粒及與納米顆粒組分完全相同的姜黃素-玉米醇溶蛋白-果膠的混合物，評價模擬消化后消化液溶解的姜黃素的量，不能溶解于消化液中的姜黃素被認為不能被人體吸收利用。以消化液中的姜黃素與消化前納米顆粒或混合物中姜黃素的百分比表示姜黃素的吸收率，結果表明，納米顆粒包埋的姜黃素消化吸收率為14.8%，而混合物中姜黃素的消化吸收率僅為3.6%(P<0.05)。姜黃素幾乎不溶于水，為了增加消化后的姜黃素在水中的溶解度，在模擬胃液消化中添加了質量分數為0.05%的吐溫80，以乳化劑的膠束溶解消化后釋放的姜黃素。因此，可以認為姜黃素、醇溶蛋白和果膠混合物中的姜黃素能最大限度地被吐溫80膠束分散的百分數為3.6%，而納米顆粒包埋的姜黃素的吸收率增加了4倍。

表1 姜黃素納米顆粒對不同菌株的抑菌能力Table 1 Antimicrobial activity of of curcumin loaded zein/polysaccharide nanoparticles

注：E-Cur為納米顆粒包埋的姜黃素； DMSO-Cur為DMSO溶解的姜黃素； “-”抑菌環直徑<10 mm，為無抑菌作用。

3 討論

玉米醇溶蛋白等電點約為6.2[7]，在pH=4時，蛋白質帶正電荷，帶陰離子的果膠和海藻酸鈉因靜電相互作用吸附到玉米醇溶蛋白納米顆粒的表面，形成核-殼型復合納米顆粒，并因多糖陰離子的電荷排斥而保持穩定[8]。本課題組前期研究發現，當海藻酸鈉替代30%的果膠時，納米顆粒在中性pH范圍能保持穩定[9]。本文在此基礎上研究納米顆粒的生物活性。納米顆粒負載的姜黃素表現出比乙醇溶解的姜黃素更高的清除DPPH自由基的能力，從而說明納米顆粒負載姜黃素對提高其抗氧化活性是有效的。但在評價其抗菌活性時，DMSO溶解的姜黃素表現出對革蘭陰性和陽性菌都有較好的抑制作用，而納米顆粒負載的姜黃素卻無抑菌作用。這主要是因為抑菌環法需要抗菌物質能快速擴散到瓊脂凝膠培養基內才能發揮抑菌作用，而經納米顆粒包埋的姜黃素擴散到瓊脂培養基中的速度很慢，且姜黃素不溶于水，從納米顆粒擴散出來的姜黃素不能充分分散到培養基，從而不能發揮出抗菌作用[13]。DMSO溶解的姜黃素抗菌活性與劑量之間沒有相關性，這也可以從姜黃素的極低溶解性方面去解釋。因為高濃度姜黃素溶液滴加到培養基中時，更多的姜黃素析出，不能提高它在培養基中的抗菌效果。

以模擬消化液中溶解的姜黃素占顆粒或混合物中姜黃素的相對含量表征姜黃素經消化后的吸收率，是研究人體消化吸收姜黃素的一種簡單經濟的模式[3]。人體胃腸液中存在天然的膠束，如脂肪酸膠束或膽酸鹽膠束。本文在模擬消化時，加入一定量的吐溫80，目的是盡可能地溶解分散消化釋放出的姜黃素。吐溫80的濃度遠高于其臨界膠束濃度，因此釋放出來的姜黃素能最大程度的被吐溫80膠束穩定。本文結果顯示，納米顆粒包埋的姜黃素經消化后在消化液中的濃度是同組分混合物消化后的4倍，這也充分說明經過納米顆粒包埋的姜黃素能更有效地釋放到消化液從而被人體吸收。在后續的研究中，將利用動物模型研究納米顆粒包埋的姜黃素消化吸收及體內代謝動力學。

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(責任編輯：陳翔)

Study on the preparation and biological activity of curcumin loaded zein/polysaccharide nanoparticles

HUANG Xulin1,HUANG Xiaoxia1,ZHONG Nanjing2,GAO Yongqing2,HU Kun2

(1.SchoolofPublicHealth,GuangdongParmaceuticalUniversity,Guangzhou510310,China; 2.SchoolofFoodScience,GuangdongParmaceuticalUniversity,Zhongshan528458,China)

Objective To prepare curcumin loaded zein/polysaccharide nanoparticles and study their bioactivity. Methods Curcumin loaded zein/polysaccharide core-shell biopolymer nanoparticles were synthetized with anti-solvent and electrostatic deposition method. Scanning electron microscope was used to observe the morphology; DPPH· method was carried out to evaluate the antioxidant activity; the antibacterial activity was determined by plate inhibition test and the bioavailability was detected by the simulative digestive experimentinvitro. Results The curcumin nanoparticles were spherical with smooth surface and average diameter 133 nm; the DPPH· scavenging rate of curcumin nanoparticles was superior to that of curcumin ethanol solution with SC50(13.89±0.69) μg/mL and (16.73±0.097) μg/mL,respectively. But the antimicrobial activity of nanoparticles was unsatisfactory; the bioavailability of encapsulated curcumin increased 4 times than that of free curcumin. Conclusion The encapsulated curcumin nanoparticles exhibited superior antioxidant activity and bioavailability,which might be used in functional food and medicine.

curcumin; zein; polysaccharide; nanoparticles; antioxidant

2016-06-21

廣東省科技廳國際合作項目(2015A050502051)

黃旭琳(1991—)，女，2014級碩士研究生，Email：xulin_h@163.com；通信作者：胡坤(1975—)，男，教授，從事食品活性成分及其輸送體系研究，Email：huk88@126.com。

時間：2016-09-30 16:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1639.010.html

R944

A

1006-8783(2016)05-0545-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062103