苦參生物堿和黃酮體外抑菌活性比較

黃琦，屈玟珊，高世軍，馬俊琳，劉龍元，徐麟，馬鴻雁

(廣東藥科大學 1.中藥學院，廣東 廣州 510006； 3.醫藥化工學院，廣東中山 528453； 2.廣州中醫藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

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苦參生物堿和黃酮體外抑菌活性比較

黃琦1，屈玟珊1，高世軍2，馬俊琳1，劉龍元3，徐麟1，馬鴻雁1

(廣東藥科大學 1.中藥學院，廣東 廣州 510006； 3.醫藥化工學院，廣東中山 528453； 2.廣州中醫藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

目的 探討苦參生物堿、黃酮及其單體(苦參堿、氧化苦參堿、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、5-methyl-Kushenol C、三葉豆紫檀苷和高麗槐素)對不同菌株的體外抑菌作用。方法 采用96孔板微量稀釋法測定藥物的最小抑菌濃度(MIC)；薄層色譜-直接生物自顯影法測定藥物的抑菌檢測限(LOD)；紙片擴散法測定苦參黃酮單體的抑菌圈直徑大小。結果 苦參總生物堿、總黃酮對金黃色葡萄球菌的MIC值范圍分別為4.95～31.64 mg/mL和7.50～31.64 mg/mL，對大腸埃希菌的MIC值范圍分別為1～4 mg/mL和1～4 mg/mL。苦參生物堿單體對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的LOD值均大于10 μg；黃酮單體對金黃色葡萄球菌的LOD值為1.3～2.5 μg，對大腸埃希菌的LOD值小于1.3 μg。各黃酮單體中，槐屬二氫黃酮G抑菌作用最強，其次是苦參酮和高麗槐素，三葉豆紫檀苷無抑制作用。結論 對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，苦參總黃酮及單體的抑菌效果均優于苦參總生物堿及其單體。

苦參； 生物堿； 黃酮； 微量稀釋法； 薄層色譜-直接生物自顯影； 紙片擴散法； 抑菌作用

苦參(SophoraflavescensAit.)為豆科槐屬植物，是我國歷史悠久的傳統藥物之一，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿的功效，臨床常用于濕疹、皮膚瘙癢、滴蟲性陰道炎等[1],療效顯著。生物堿成分一直被認為是苦參的主要有效成分，但并非苦參專屬性成分，山豆根、苦豆子等同科中藥具有與苦參非常相似的生物堿，卻具有明顯不同的臨床應用[2-4]，這提示僅用生物堿成分來評價苦參的質量和藥效是有局限性的，苦參中除生物堿外可能另有起關鍵作用的有效成分。近年來，大量研究表明苦參中含有豐富的黃酮類成分，具有抗菌、抗感染、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多方面的生物活性[5]。有關苦參生物堿和黃酮抑菌作用的已有很多研究報道[6-9]，但兩者抑菌活性孰強孰弱，目前僅有杜思邈等[10]對此進行了研究。本文采用微量稀釋法、薄層色譜-直接生物自顯影法和紙片擴散法比較苦參生物堿和黃酮對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、傷寒桿菌、大腸埃希菌、痢疾志賀氏菌和銅綠假單胞菌的抑制作用，為苦參新型抑菌制劑的合理開發提供理論依據。

1 材料與試藥

1.1 儀器與設備

FA(N)/IA(N)電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；AY120萬分之一天平(日本島津公司)；KQ-2200B超聲波清洗器(鞏義市予華有限公司)；WZT-1M細菌濁度儀(麥氏單位，上海勁佳科學儀器有限公司)；電熱恒溫培養箱HPX-9162MBE(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；GF254薄層板(青島海洋化工廠分廠)；96孔板(Costar公司)。

1.2 藥物與試劑

15個產地的苦參藥材由廣東藥學院生藥研究室馬鴻雁副教授提供和鑒定，經鑒定均為豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)的干燥根(表1)；苦參堿對照品(批號PS15040201)和氧化苦參堿對照品(批號PS14042001)均購自成都普思生物科技股份有限公司，純度≥98%；苦參酮、槐屬二氫黃酮G、三葉豆紫檀苷、高麗槐素和5-methyl-Kushenol C均為自制對照品，經HPLC峰面積歸一化法計算，純度均大于98%；普通營養肉湯、營養瓊脂(BS1002；BS1003；杭州百思生物技術有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑顯色劑(TTC，Amresco公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽顯色劑(MTT，Aladdin 公司)；其他試劑均為分析純。

表1 15個產地苦參樣品的來源Table 1 Origins of Sophora flavescens Ait.

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC29213)、大腸埃希菌(Escherichiacoli，ATCC25922)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，ATCC49619)、傷寒桿菌(Salmonellatyphi，ATCC14028)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae，CMCC51252)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，ATCC2783)均購于廣東省微生物菌種保藏中心，經廣東藥科大學基礎學院微生物教研室進行傳代培養，并由馬艷高級實驗師鑒定確認后惠贈。將上述菌種接種于營養瓊脂中,置37 ℃恒溫培養箱培養24 h,4 ℃保存備用。

2 方法

2.1 培養基制備

普通營養肉湯、營養瓊脂均按說明書方法配制，121 ℃高壓滅菌30 min，備用。

2.2 顯色劑

TTC顯色劑：用蒸餾水配制成2.5 mg/ml TTC溶液，避光保存，備用。

MTT顯色劑：用PBS緩沖液配制成質量濃度為5 mg/mL的MTT-PBS溶液。

2.3 苦參總生物堿提取物的制備

取15個產地苦參飲片10.0 g，加蒸餾水100 mL，煎煮30 min，趁熱濾過，殘渣加100 mL蒸餾水同法煎煮1次，濾過；合并濾液，濃縮至含生藥500 mg/mL，4 ℃保存備用。

2.4 苦參總黃酮提取物的制備

參照文獻[11]方法制備得到15個產地苦參總黃酮提取液，濾液蒸干，取適量浸膏配成質量濃度為32 mg/mL的儲備液。實驗時取適量儲備液過0.45 μm微孔濾膜，用蒸餾水配成質量濃度為8 mg/mL的初始濃度藥液。

2.5 溶液的制備

取苦參堿、氧化苦參堿、苦參酮、槐屬二氫黃酮G和5-methyl-Kushenol C對照品，分別加甲醇配成初質量濃度為2 mg/mL對照品溶液，然后倍比稀釋成1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL甲醇溶液，備用。

取三葉豆紫檀苷、槐屬二氫黃酮G、苦參酮、高麗槐素，分別精密稱定1.0 mg，用蒸餾水配成質量濃度為0.1 mg/mL的藥物原液，備用。

配制質量濃度為2.5 mg/mL的氨芐西林藥液作為陽性對照，備用。

2.6 菌懸液制備

受試菌種用液體培養基配成菌懸液后，再用細菌濁度儀配制成濃度為5×108CFU/mL的菌液，備用。

2.7 微量稀釋法測MIC值

參照文獻[12]采用微量稀釋法測定樣品對不同菌株的MIC值，96孔板置37 ℃培養箱中培養18～24 h，培養結束前3 h每孔加入2.5 mg/mL TTC溶液10 μL，繼續培養1～3 h后觀察生長情況，有細菌生長孔呈紅色，以肉眼觀察不到菌落生長的最低藥物濃度為該藥物對該種細菌的MIC。

2.8 薄層色譜-直接生物自顯影評價抑菌能力

參照文獻[13]采用直接生物自顯影方法評價苦參單體化合物對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。處理過的薄層板在37 ℃下培養10 h；培養結束后將5 mg/mL MTT-PBS溶液均勻噴灑到薄層板上，37 ℃下培養4～5 h后觀察顯色結果，有抑菌活性的斑點將在顯色背景下表現出明顯的抑菌圈。

2.9 紙片擴散法測定抑菌圈直徑

取菌懸液0.2 mL涂布于瓊脂培養基上，將滅菌的濾紙片(直徑d0=7 mm)浸泡于藥液中片刻，取出，略干后貼于平板表面，2%吐溫80濾紙片為陰性對照，37 ℃培養24 h，測定抑菌圈直徑(d)。

3 結果

3.1 15個產地苦參的最小抑菌濃度(MIC)

苦參總生物堿和總黃酮的MIC結果見圖1。由結果可知，不同產地苦參均有一定的抑菌作用，苦參總生物堿對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC值范圍分別為4.95～31.64 mg/mL和7.50～31.64 mg/mL；苦參總黃酮對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC值的范圍均為1～4 mg/mL。通過比較苦參總生物堿和總黃酮的MIC，15個產地中湖南邵陽(6)所產苦參的抑菌效果最好，其次是河南南陽(1)和云南曲靖(7)。

圖1 15個產地苦參總生物堿和總黃酮對金黃色葡萄球菌(A)和大腸埃希菌(B)的MICs

Figure 1 MICs of extracts from differentSophoraflavescensAit. againstStaphylococcusaureus(A) andEscherichiacoli(B)

3.2 苦參生物堿和黃酮單體的抑菌檢測限(LOD)

苦參堿、氧化苦參堿、槐屬二氫黃酮G、苦參酮和5-methyl-Kushenol C抑菌作用的結果見圖2。苦參堿、氧化苦參堿對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的LOD值均大于10 μg；槐屬二氫黃酮G、苦參酮和5-methyl-Kushenol C對金黃色葡萄球菌的LOD值為1.3～2.5 μg，對大腸埃希菌的LOD值均小于1.3 μg。結果表明，相同濃度下，無論是金黃色葡萄球菌還是大腸埃希菌，黃酮單體的抑菌效果都明顯優于生物堿單體。

3.3 苦參黃酮單體的抑菌圈直徑

5個苦參黃酮單體抑菌作用的結果見表2。可見，槐屬二氫黃酮G、苦參酮和高麗槐素對細菌均有抑制作用；槐屬二氫黃酮G抑菌作用最強，對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌)和革蘭陰性菌(大腸埃希菌、傷寒桿菌和痢疾志賀菌)均有一定抑制作用；苦參酮和高麗槐素抑菌作用相當，都只對革蘭陽性菌有抑制作用，對革蘭陰性菌無抑制作用；三葉豆紫檀苷作用最弱，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均無抑制作用；氨芐西林和苦參各成分對革蘭陰性菌銅綠假單胞菌均無抑制作用。

A.苦參堿； B.氧化苦參堿； C.槐屬二氫黃酮G； D.苦參酮； E.5-methyl-Kushenol C。

圖2 直接TLC生物自顯影比較苦參生物堿和黃酮單體化合物對金黃色葡萄球菌(左)和大腸埃希菌(右)的抑制作用

Figure 2 Comparison ofSophoraflavescensalkaloid and flavonoid monomers againstStaphylococcusaureus(left) andEscherichiacoli(right) by TLC-direct bioautography

表2 苦參黃酮單體的抑菌圈直徑

注：濾紙片直徑d0=7 mm。“-”表示對相應供試菌種無抑制效果。

4 討論

苦參主要成分是以苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿等為主的生物堿類化合物和以苦參酮、槐屬二氫黃酮G、三葉豆紫檀苷、Kushenol I等為主的黃酮類化合物。生物堿提取常用三氯甲烷、三氯甲烷+濃氨水、水等作為提取溶劑，由于三氯甲烷有毒，而三氯甲烷+濃氨水溶液提取法操作繁瑣、耗時，目前生物堿提取主要是用水煎煮或回流提取[14-15]；黃酮提取常用甲醇、乙醇、乙酸乙酯等超聲提取，其中以乙酸乙酯超聲提取法對苦參黃酮類成分提取效率最高，雜質斑點較少，故本文選用該法提取苦參總黃酮[11,16]。本文采用微量稀釋法、薄層色譜-直接生物自顯影法和紙片擴散法同時比較苦參總生物堿和總黃酮對不同細菌的抑制作用，結果顯示苦參黃酮化合物的抑菌效果明顯強于生物堿，與杜思邈等[10]報道的結果一致。

中藥及其有效部位的抑菌機制較為復雜且不完善，主要是通過改變藥物的親脂性,改變菌體細胞膜和離子通道的滲透性,抑制或干預菌體生物功能的合成、轉化過程等來改變抑菌活性[17]。革蘭陽性菌和革蘭陰性菌結構、成分、性質和功能的差異[18]，以及生物堿和黃酮結構的差異都會影響抑菌的效果。就構效關系而言，生物堿的抑菌活性與其氮原子的存在方式和結構修飾有關[19]，黃酮的抑菌活性主要與A、B、C環上的羥基化和A、C環上的O、S、N取代有關，其中大多數異戊烯黃酮自身結構的特異性(容易羥基化和異戊烯基化)能增強其抑菌或殺菌活性[20-22]。Kohanski等[23]發現，殺菌性抗菌藥能刺激革蘭氏菌生成高度有害的羥基自由基，增加殺菌性抗菌藥的殺菌效果，導致細胞死亡，而抑菌性抗菌藥并不產生羥基自由基。這提示藥物的抑菌效果可能與其羥基自由基的合成和藥物濃度也有關系，為更好地篩選殺菌性抗菌藥和抑菌性抗菌藥，以及研究藥物的殺菌活性和抑菌活性提供了科學依據。

生物堿和黃酮都是廣泛存在于植物中較為復雜的化合物，也是藥用植物中的主要活性成分，均具有廣譜的藥理活性和較低毒性。本文結果表明，苦參總黃酮及其單體均是有潛力的抗菌藥物，提示研究苦參制劑抑菌作用時，可同時考慮其生物堿和黃酮作為有效部位。生物堿和黃酮對苦參的貢獻是單獨作用、協同作用，還是拮抗作用，還有待在今后繼續研究。

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(責任編輯：陳翔)

Comparison ofinvitroantibacterial activity of alkaloids and flavonoids ofSophoraflavescensAit.

HUANG Qi1,QU Wenshan1,GAO Shijun2,MA Junlin1,LIU Longyuan3,XU Lin1,MA Hongyan1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 3.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Zhongshan528453,China)

Objective To studyinvitroantibacterial activity of alkaloids,flavonoids and their monomers (matrine,oxymatrine,kurarinone,sophoraflavanone G,5-methyl-kushenol C,trifolirhizin and maackiain) ofSophoraflavescensAit. Methods Broth microdilution method with 96-well plate was used to determine MICs of extracts ofSophoraflavescensAit. The limit of detection (LOD) against different bacteria was determined by thin-layer chromatography (TLC)-direct bioautography. Disk diffusion method was used to determine the diameters of inhibition zone of flavonoid constituents. Results MICs of tatal alkaloids and total flavonoids againstStaphylococcusaureusandEscherichiacoliwere 4.95～31.64 mg/mL,7.50～31.64 mg/mL,1～4 mg/mL,and 1～4 mg/mL,respectively. The LODs of alkaloid monomers againstStaphylococcusaureusandEscherichiacoliwere both more than 10 μg,while flavonoid monomers′ were 1.3～2.5 μg and less than 1.3 μg,respectively. Sophoraflavanone G had the strongest antibacterial activity against the testing bacteria among all flavonoid monomers,followed by Kurarinone and Maackiain,while Trifolirhizin had no antibacterial activity. Conclusion The total flavonoids and flavonoid monomers ofSophoraflavescenshad a stronger antibacterial activity against bothStaphylococcusaureusandEscherichiacolithan tatal alkaloids and alkaloid monomers.

SophoraflavescensAit.; alkaloids; flavonoids; broth microdilution method; TLC-direct bioautography; disk diffusion method; antimicrobial

2016-07-10

清華信息科學與技術國家重點實驗室項目(44548071)；廣東省科技計劃項目(2014A020212416)；廣東藥學院2013年大學生創新創業訓練計劃項目(201310573004)

黃琦(1991—)，女，2014級碩士研究生，Email：459995268@qq.com；通信作者：馬鴻雁(1981—)，女，副教授，博士，主要從事中藥的活性成分及質量評價研究。

時間：2016-10-08 11:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161008.1138.001.html

R285.5

A

1006-8783(2016)05-0577-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016071001