高效液相色譜法同時測定抗骨增生膠囊中的毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷

朱燕，黃義純，嚴曉明

(韶關市食品藥品檢驗所，廣東 韶關 512028)

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藥物分析

高效液相色譜法同時測定抗骨增生膠囊中的毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷

朱燕，黃義純，嚴曉明

(韶關市食品藥品檢驗所，廣東 韶關 512028)

目的 建立同時測定抗骨增生膠囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3種成分質量分數的高效液相色譜法。方法 采用依利特Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以水(A)、甲醇(B)、乙腈(C)為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30 ℃。結果 毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷測定的線性范圍分別為5.02～100.4、7.38～147.6 和5.20～104.0 μg/mL，r值均大于0.999，平均加樣回收率分別為100.7%、100.4%和99.3%，RSD值均小于2.0%(n=6)。結論 本方法簡便、結果準確，可有效地控制抗骨增生膠囊的質量。

高效液相色譜； 抗骨增生膠囊； 毛蕊花糖苷； 柚皮苷； 淫羊藿苷

抗骨增生膠囊為國家基本醫療保險藥品目錄收載品種,是由熟地黃、雞血藤、酒肉蓯蓉、炒萊菔子、狗脊、骨碎補、女貞子(鹽制)、淫羊藿、牛膝9味中藥制成的中藥成方制劑,收載于《中國藥典》2015年版一部[1]950，用于增生性脊椎炎(肥大性胸椎炎，肥大性腰椎炎)、頸椎綜合征和骨刺等疾病[2]。熟地黃、淫羊藿、骨碎補均為該復方制劑的主要藥味，其主要活性成分分別為毛蕊花糖苷(verbascoside)、淫羊藿苷(icariine)等黃酮類和柚皮苷(naringin)等二氫黃酮類化合物[1]256，124，其藥效與該制劑功能主治相一致?？构窃錾z囊現行標準[1] 950僅對淫羊藿苷進行質量分數測定，未能全面控制其質量，國內亦未見對抗骨增生膠囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3種有效成分質量分數同時進行測定的報道及文獻。為了較全面控制抗骨增生膠囊質量并簡化其測定方法，筆者參考文獻[1] ，[2-4]，以毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷為指標性成分，采用HPLC法同時測定它們在抗骨增生膠囊中的質量分數，以控制方中熟地黃、淫羊藿、骨碎補等主藥的質量。

1 儀器與試藥

Agilent1260 高效液相色譜儀(包括VWD 檢測器LC solution 工作站)，AG-135 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，HT-300BQ 超聲儀(山東濟寧恒通超聲電子設備有限公司)，Shimadzu UV-2450 紫外分光光度計。

毛蕊花糖苷對照品(批號111530-201512,質量分數96.7%)、柚皮苷對照品(批號110722-201312,質量分數94.7%)、淫羊藿苷對照品(批號110737-201516,質量分數94.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院，抗骨增生膠囊購自江蘇康緣藥業股份有限公司(0.35 g/丸，批號：141105、141209、150501)。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為依利特Hypersil ODS2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為H2O(A)-甲醇(B)-乙腈(C)，按表1程序進行梯度洗脫。檢測波長為270 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

表1 抗骨增生膠囊中3種有效成分測定的梯度洗脫程序

Table 1 Gradient elution program of three active ingredients in Kanggu Zengsheng capsules

t/minφ(流動相A)/%φ(流動相B)/%φ(流動相C)/%08002013800201470525267052528800203780020

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，用50%乙醇(體積分數，下同)溶解并定量稀釋制成質量濃度分別為0.502、0.738、0.520 mg/mL 的溶液，作為對照品儲備溶液。分別精密量取上述3種對照品儲備溶液2 mL，置于同一20 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷質量濃度分別為0.050 2、0.073 8、0.052 0 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取抗骨增生膠囊內容物10粒，精密稱定，混勻，研細,取約0.7 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇50 mL，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)45 min，放冷，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方量制備缺熟地黃、淫羊藿和骨碎補的樣品，同“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統適用性試驗

分別精密吸取混合對照品、供試品、陰性樣品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，見圖1。結果理論塔板數按毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷計算均不低于3 500，3種成分色譜峰與相鄰峰之間分離度均大于1.5，對稱因子在0.95～1.05 內；陰性對照無干擾。

t/min6040200200150100500806040200mAUmAUmAUABC12332110152025303505

1.毛蕊花糖苷； 2.柚皮苷； 3.淫羊藿苷。

圖1 混合對照品(A)、供試品(B)和陰性樣品(C)溶液的HPLC色譜圖

Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A),sample(B) and negative sample(C)

2.4 線性關系的考察

分別精密量取毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷對照品儲備液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL，置于同一25 mL容量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以峰面積(A)對質量濃度(ρ)進行線性回歸，得到3種成分的回歸方程、r及線性范圍，結果見表2。

表2 抗骨增生膠囊中3種成分的回歸方程、r值及線性范圍

Table 2 Regression equations,rvalues and linear ranges of three constituents in Kanggu Zengsheng capsules

成分回歸方程r線性范圍/(μg·mL-1)毛蕊花糖苷A=8.422ρ+19.231230.99925.02～100.4柚皮苷A=8.317ρ+20.125380.99967.38～147.6淫羊藿苷A=20.971ρ+25.361840.99965.20～104.0

2.5 檢測限的測定

將“2.4”項下質量濃度最低的對照品溶液逐級稀釋，依法進行測定，當各成分峰的信噪比為3∶1時，計算得毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷的最低檢測限分別為0.22、0.30、0.13 ng。

2.6 精密度試驗

取同一批供試品溶液(批號：150501)10 μL，連續進樣6次，按“2.1”項下色譜條件測定并記錄色譜圖。結果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面積平均值的RSD值(n=6)分別為0.72%、0.77%、0.58%，表明本法精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取同一批供試品溶液(批號：150501)，分別于制備后0、4、8、12、16、20、24 h進樣，按“2.1”項下色譜條件測定并記錄色譜圖。結果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面積平均值的RSD值(n=7)分別為0.82%、0.68%、0.79%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 重復性試驗

平行取同一批抗骨增生膠囊(批號：150501) 共6 份，每份0.7 g，精密稱定，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定并記錄峰面積。結果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面積的RSD 值分別為1.5%、1.2%和1.0%，表明方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

分別取已知質量分數(毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷分別為0.39、0.56、0.51 mg/丸)的抗骨增生膠囊(批號：150501)約0.7 g，精密稱定，共6份，分別精密加入3種對照品儲備液0.5 mL，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定并計算回收率。結果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷的平均加樣回收率分別為100.7%、100.4%、99.3%，RSD值(n=6)分別為1.7%、1.6%、1.3%。結果見表3。

表3 抗骨增生膠囊中3種有效成分的加樣回收率試驗結果Table 3 Recovery results of three active ingredients in Kanggu Zengsheng capsules (n=6)

2.10 樣品的測定

分別取3批抗骨增生膠囊(批號：141105、141209、150501)，約0.7 g，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每批平行處理3份，按“2.1”項下色譜條件測定，按峰面積外標法計算其中3種有效成分的質量分數，結果見表4。

表4 抗骨增生膠囊中3種有效成分的質量分數測定結果

3 討論

3.1 流動相的選擇

由于抗骨增生膠囊中各成分性質差異較大，為使3種有效成分達到良好分離效果，筆者分別以不同比例的乙腈-水、乙腈-0.1%(體積分數)醋酸等為流動相系統[4-7]對色譜條件進行考察，但分離效果均不甚理想。如以乙腈-水(體積比20∶80)為流動相時，毛蕊花糖苷、柚皮苷出峰好，但淫羊藿苷保留時間過長，而且雜質分離效果差，峰形較差；經過進一步對比研究，最終選擇甲醇-乙腈-水三相系統為流動相梯度洗脫，可消除雜質對被測成分的干擾，各成分的色譜峰峰形對稱、理論塔板數高、分離度好，縮短了多成分檢測的分析時間。

3.2 波長的選擇

采用紫外可見分光光度法檢測毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷對照品溶液，以初始比例流動相為空白，在200～400 nm范圍內進行掃描，兼顧多種成分的最大吸收，重點考察334、284、270 nm波長處的效果。結果發現在270 nm波長處，3種有效成分均有較強吸收，因此選擇淫羊藿苷的最大吸收波長270 nm作為檢測波長，可同時得到3種成分較好的色譜峰，并能滿足定量測定的要求。

3.3 樣品前處理方法的確定

筆者分別對文獻中較常見的冷浸法、回流提取法、超聲法[4-7]這3種提取方法方法進行了考察，結果顯示：采用冷浸法提取時，為獲得較好的效果，需不定期振搖，且浸泡時間長、提取效率較低；回流提取40 min可基本提取完全，但提取溫度較高，可能對其活性成分產生較大的影響，活性成分質量分數隨著溫度的提高均有不同程度的降低[8]；而超聲法可在30 min內基本提取完全，且具有提取時間短、提取溫度低、提取率高等特點，所以選用超聲法提取?？疾炝颂崛r間分別為15、30、45、60 min時的超聲提取效果，結果表明，超聲處理30 min 后各成分質量分數不再增加，考慮到樣品間的差異性，選擇超聲處理45 min。在提取溶劑方面，分別采用乙醇、50%乙醇、50%甲醇、甲醇作為溶劑對樣品進行提取。結果表明：50%甲醇和50%乙醇超聲提取完全且雜質干擾峰較少，結果差異不大；但甲醇毒性較乙醇大，結合經濟實用的角度考慮，選擇50%乙醇作為提取溶劑。

本文所確定方法操作簡便、重復性好、準確穩定，能快速、準確地對抗骨增生膠囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3種成分同時進行定量測定，為該制劑質量標準的提高提供了重要參考。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一部[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2] 朱靜，楊青青.抗骨增生膠囊中柚皮苷的HPLC法測定[J].中國醫藥工業雜志,2013，44(8):795.

[3] 韓麗萍，陳行愉，劉志剛.HPLC法同時測定抗骨質疏松中成藥中柚皮苷及淫羊藿苷的含量[J].中國藥房,2010，21(43):4083-4085.

[4] 韓麗萍，陳行愉，鄧偉民.HPLC法同時測定補腎壯骨顆粒中淫羊藿苷及柚皮苷含量[J].中成藥，2011，33(1)：184-186.

[5] 薛標強，袁潔麗.HPLC法測定抗骨增生片中柚皮苷的含量[J].輕工科技，2014，1(1):105-106.

[6] 徐燦輝，何維為，何云飛.HPLC 法測定六味地黃膠囊中的毛蕊花糖苷、馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚[J].現代藥物與臨床,2014,37(3):257-259.

[7] 張智軍，崔華，馬久太.HPLC 法測定抗骨增生片中柚皮苷含量[J].世界中醫藥，2012，7(4):360-361.

[8] 王亮，張巧艷，年華，等.用HPLC法測定地黃葉中毛蕊花糖苷的含量[J].藥學服務與研究,2015，15(1):26，30，46.

(責任編輯：劉曉涵)

Simultaneous determination of verbascoside,naringin and icariin in Kanggu Zengsheng capsules by HPLC

ZHU Yan,HUANG Yichun,YAN Xiaoming

(ShaoguanInstituteforFoodandDrugControl,Shaoguan512028,China)

Objective To establish an HPLC method for determinations of three constituents(verbascoside,naringin and icariin ) in Kanggu Zengsheng capsules. Methods HPLC gradient elution method was applied. The column was Elite Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm,5 μm). The mobile phase was water(A),methanol(B)and acetonitrile(C) solution. The detection wavelength was set at 270 nm and the column temperature was 30 ℃. Results The linear range was 5.02-100.4 μg/mL for verbascoside,7.38-147.6 μg/mL for naringin and 5.20-104.0 μg/mL for icariin,respectively. All the correlation coefficients were above 0.999. The average recovery was 100.7% for verbascoside,100.4% for naringin,and 99.3% for icariin,respectively,and all RSD values were less than 2.0%(n=6). Conclusion The developed HPLC method could be used for the quality control of Kanggu Zengsheng capsules.

HPLC; Kanggu Zengsheng capsules； verbascoside; naringin；icariin

2016-06-23

朱燕(1983—)，本科，主管藥師，從事藥品質量檢驗與質量控制研究，Email：29711825@qq.com；通信作者：嚴曉明(1979—)，副主任藥師，從事藥品質量檢驗與質量控制研究，Email：99075234@qq.com。

時間：2016-09-30 15:09

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1509.009.html

R284.1

A

1006-8783(2016)05-0589-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062301