六味地黃丸含藥血清對Eahy926細胞ERK/Nrf2-HO-1信號通路的影響

呂小輝，孫佳瑜，蔡智剛，張瑞鵬，單愛云

(1.深圳市福田區中醫院，廣東 廣東 518033； 2.深圳清華大學 研究院，廣東 廣州 518067)

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六味地黃丸含藥血清對Eahy926細胞ERK/Nrf2-HO-1信號通路的影響

呂小輝1，孫佳瑜1，蔡智剛1，張瑞鵬2，單愛云1

(1.深圳市福田區中醫院，廣東 廣東 518033； 2.深圳清華大學 研究院，廣東 廣州 518067)

目的 觀察六味地黃丸含藥血清對人血管內皮細胞Eahy926增殖及其ERK/Nrf2-HO-1信號通路的影響。方法 CCK-8檢測大鼠5%、10%、20%空白血清與5%、10%、20%含藥血清對Eahy926細胞增殖的影響，并用Western-blotting方法檢測10%含藥血清對Eahy926細胞ERK/Nrf2-HO-1信號通路分子蛋白表達的影響。結果 六味地黃丸含藥血清可以促進Eahy926細胞的增殖；在Eahy926細胞中，10%六味地黃丸含藥血清能夠促進ERK的磷酸化、Nrf2核轉位和HO-1蛋白的表達，明顯高于無大鼠血清組和10%空白血清組。結論 10%六味地黃丸含藥血清誘導ERK磷酸化介導Nrf2入核和HO-1蛋白的表達。

六味地黃丸； 血管內皮細胞； ERK/Nrf2-HO-1； 蛋白表達

血紅素加氧酶(HO)是哺乳動物內源性保護酶，是體內血紅素代謝的起始酶和限速酶，主要將血紅素代謝成膽綠素、一氧化碳和游離的鐵離子。HO在體內有HO-1、HO-1、HO-3 3種同工酶，其中HO-1為可誘導型HO，參與體內眾多抗氧化事件。血紅素加氧酶-1(HO-1)表達需要其核轉錄因子Nrf2激活后入核與相應的啟動子結合，Nrf2的激活與ERK的磷酸化有著密切關系，磷酸化的ERK可以促進Nrf2激活，與封閉蛋白解離入核，進而促進HO-1蛋白的表達。以往研究發現六味地黃丸含藥血清[1]和激活ERK/Nrf2-HO-1信號通路[2]都具有血管內皮保護作用，推測六味地黃丸含藥血清可能具有激活ERK/Nrf2-HO-1信號通路的作用。本研究主要觀察六味地黃丸含藥血清在血管內皮細胞上對ERK/Nrf2信號通路是否有調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠20只，體質量180～220 g，廣州醫學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

1.1.2 藥物 六味地黃丸購于北京同仁堂，批號20150415，取六味地黃丸100丸(每8丸相當于生藥材量3 g)，機械粉碎成粗粉，加入50 mL蒸餾水混勻，濃縮至1.56 kg/L的藥液。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養基(Hyclone)；胎牛血清(PAN)；0.25%胰酶(Hyclone)；BCA蛋白定量試劑盒和CCK-8試劑盒(碧云天科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(Solarbio)；ERK和p-ERK一抗(SatanCruz)；Nrf2和HO-1一抗(abcam)；β-actin和所有的二抗(中杉金橋)；U0126(CST)。

1.1.4 主要儀器 Forma-371型CO2培養箱(Thermo)；5418R型低溫冷凍離心機(Effendorf)；EN12469型超凈工作臺(ESCO)； A2LED型倒置顯微鏡(Zeiss)；elx-808型全自動酶標儀(Biotek)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 將SD大鼠隨機分為空白組和六味地黃丸給藥組，每組各10只，通過預實驗確定給藥組生藥濃度為1.56 kg/L六味地黃丸混懸液，10 mL/kg灌胃，每天1次，空白組給予同體積生理鹽水灌胃，連續給藥3 d，第4天給藥后2 h心臟取血，4 ℃冰箱過夜，5 000 r/min離心5 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補體，超濾滅菌，-80 ℃保存備用。

1.2.2 Eahy926細胞培養 人血管內皮細胞株Eahy926，在含10%(φ)胎牛血清的DMEM培養基，5%(φ)CO2、37 ℃恒溫條件下培養。

1.2.3 含藥血清對Eahy926細胞增殖的影響 細胞生長融合度80%以上，消化細胞成單細胞懸液，以5×107cells/mL單細胞懸液100 μL接種于96孔板中，當細胞生長融合度達80%時，使用基礎培養基同步化24 h，將細胞分為無大鼠血清組、正常大鼠血清(NS)組(5%、10%、20%)和給藥大鼠血清(MS)組(5%、10%、20%)每組設6個復孔，培養48 h后，加入CCK-8試劑37 ℃培養箱孵育2 h后，用酶標儀在490 nm波長下檢測每孔細胞吸光度值(A值)。

1.2.4 細胞蛋白提取和Western blotting檢測[3]用預冷的PBS清洗培養皿3次，用預冷的RIPA蛋白裂解液刮取細胞，冰上裂解15 min后，14 000 r/min離心15 min，取上清。從上清中取少量按照BCA蛋白定量試劑盒定量后，用上樣緩沖液將所有樣品調制相同濃度，混勻100 ℃變性5 min，分裝凍存。蛋白上樣20 μL，垂直電泳跑膠，積層膠電壓為80 V，分離膠電壓為110 V，濕轉轉膜至NC膜上，脫脂奶粉封閉，一抗過夜，洗膜后二抗孵育，加顯影液凝膠成像曝光。

1.2.5 含藥血清對HO-1表達的作用 將細胞鋪于直徑60 mm的平皿中，分為無大鼠血清組、正常大鼠血清組[U1]和給藥大鼠血清組，正常大鼠血清組和給藥大鼠血清組分別用10%的正常大鼠血清和10%給藥大鼠血清孵育細胞48 h，提取細胞蛋白，用Western blot檢測HO-1蛋白的表達。

1.2.6 含藥血清對Nrf2轉位的作用 將細胞鋪于直徑60 mm的平皿中，分為無大鼠血清組、正常大鼠血清組和給藥大鼠血清組，正常大鼠血清組和給藥大鼠血清組分別用10%的正常大鼠血清和10%含藥大鼠血清孵育細胞48 h，提取細胞核蛋白，用Western blot檢測Nrf2蛋白的表達。

2 結果

2.1 CCK-8檢測不同濃度的含藥血清對Eahy926細胞增殖的影響

表1結果提示，與無大鼠血清組比較，3個濃度給藥大鼠血清組和10%、20%的正常大鼠血清組吸光度值明顯增高(P<0.05)；這說明給藥大鼠血清和10%、20%的正常大鼠血清能夠促進細胞的增殖；10%、20%的無大鼠血清組與同濃度的給藥大鼠血清組比較吸光度值差異無統計學意義，5%給藥大鼠血清組與5%正常大鼠血清組吸光度值比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 CCK-8法測定各組Eahy926細胞A值

組別正常大鼠血清給藥大鼠血清無大鼠血清組0.54±0.120.55±0.145%血清組0.56±0.140.79±0.13*#10%血清組0.71±0.15*0.81±0.15*20%血清組0.83±0.16*0.83±0.17*

與無大鼠血清組比較：*P<0.05；與5%正常大鼠血清組比較：#P<0.05。

2.2 含藥血清對HO-1表達的作用

實驗結果提示，給藥大鼠血清能夠誘導HO-1蛋白的表達，并具有劑量依賴性，與無大鼠血清組比較差異有統計學意義(P<0.05)；10%正常大鼠血清對HO-1的表達沒有作用，與無大鼠血清組比較差異無統計學意義(圖1)。

Con10%NS5%MS10%MS20%MSHO-1β-actin3.53.02.52.01.51.00.50HO-1/β-actin*****Con10%5%10%20%NSMS

與無大鼠血清組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖1 含藥血清在Eahy926細胞上對HO-1表達的影響

2.3 含藥血清對Nrf2轉位的作用

實驗結果提示，10%給藥大鼠血清能夠促進核轉錄因子Nrf2核轉位，與無大鼠血清組比較差異有統計學意義(P<0.01)；10%正常大鼠血清對核轉錄因子Nrf2核轉位沒有作用，與無大鼠血清組比較差異無統計學意義(圖2)。

2.4 含藥血清誘導ERK磷酸化介導Nrf2核轉位和HO-1表達的作用

如圖3A所示，10%給藥大鼠血清能夠明顯誘導ERK的磷酸化，與無大鼠血清組比較差異有統計學意義(P<0.01)，而10%正常大鼠血清不能誘導ERK的磷酸化，如圖3B，3C所示加入ERK磷酸化特異抑制劑U0126后，U0126阻斷了10%給藥大鼠血清誘導Nrf2的核轉位和HO-1的表達。以上結果提示，10%給藥大鼠血清誘導ERK的磷酸化介導Nrf2核轉位和HO-1表達。

**Con10%NS10%MSNrf2(Nucleus)β-actin3.53.02.52.01.51.00.50Nrf2/β-actinCon10%NS10%MS

與無大鼠血清組比較：**P<0.01。

圖2 含藥血清在Eahy926細胞上對Nrf2核轉位的影響

3 討論

血管內皮細胞是覆蓋在血管內層的一層細胞，是循環血液與血管平滑肌的機械屏障，具有多種生理功能，參與機體的凝血、免疫、物質轉運和生物活性物質釋放等生命活性，血管內皮損傷是心血管疾病的病理基礎，保護血管內皮細胞損傷，對減少心血管疾病意義重大。以往研究表明，HO-1對血管內皮細胞損傷具有保護作用，能夠促進血管內皮細胞的增殖[4 ]，減少血管內皮細胞的凋亡[5]，對抗內皮細胞氧化應激[6]，修復內皮損傷[7]。HO-1表達與其轉錄因子Nrf2入核密切相關，對HO-1的表達發揮重要的作用，基礎狀態下Nrf2與Keap-1偶聯在一起，以非活化的形態存在于細胞之中，在啟動因素刺激下，Nrf2被激活與Keap-1解偶聯，進入細胞核與ARE相互作用，啟動HO-1基因轉錄，促進HO-1的表達。以往的研究顯示，ERK信號通路的激活與Nrf2的活化入核有著密切的關系[8]，一些自然產物能夠活化ERK促使Nrf2磷酸化入核，與核內相應啟動子結合，增加HO-1的表達[9-10]。

**10%MS10%NSConp-ERKERK2.01.51.00.50P-ERK/ERKCon10%NS10%MS+-+-++--0.70.60.50.40.30.20.10HO-1/β-actinMS(10%)U0126HO-1β-actin**##Con10%MS10%MS+U0126U0126AC**##MS(10%)U0126Nrf2β-actin+-+-++--1.41.21.00.80.60.40.20Nrf2/β-actinCon10%MS10%MS+U0126U0126B

A. 10%給藥大鼠血清對ERK磷酸化的作用(與無大鼠血清組比較：**P<0.01)； B. ERK磷酸化抑制劑U0126阻斷10%給藥大鼠血清促進Nrf2表達的作用(與無大鼠血清組比較：**P<0.01; 與U0126組比較:##P<0.01); C. ERK磷酸化抑制劑U0126阻斷10%給藥大鼠血清促進HO-1表達的作用(與無大鼠血清組比較：**P<0.01; 與10%給藥大鼠血清組比較：##P<0.01)。

圖3 含藥血清在Eahy926細胞上誘導ERK磷酸化介導Nrf2入核和HO-1蛋白

六味地黃丸組方源于宋代醫學家錢乙的《小兒藥證直決》是滋補腎陰的基礎方劑配伍組方上具有“三補三瀉”的特點，主要由熟地、澤瀉、山萸肉、丹皮、山藥、茯苓六味中藥組成，具有滋陰益腎的作用，現代醫學研究發現六味地黃丸具有抗癌、增加細胞免疫性、調節血壓血脂[11]、降低血糖、血脂、抗氧化等作用[12]，而六味地黃丸含藥血清對HO-1表達及上游ERK/Nrf2信號通路的研究報道很少。本實驗研究發現5%六味地黃丸的給藥血清能夠對血管內皮細胞Eahy926增殖有促進作用，與對照組和空白血清組比較差異有統計學意義，同時發現10%六味地黃丸含藥血清能夠促進ERK的磷酸化，并且使用ERK磷酸化的特異抑制劑U0126能夠阻斷ERK的磷酸化，同時也阻斷10%六味地黃丸含藥血清對HO-1的誘導表達和轉錄因子Nrf2的入核，結果提示，10%六味地黃丸含藥血清誘導ERK磷酸化介導Nrf2入核和HO-1蛋白的表達。本文只是初步探討了10%六味地黃丸含藥血清對ERK/Nrf2-HO-1信號通路的調節作用，六味地黃丸含藥血清是否通過ERK/Nrf2-HO-1信號通路對損傷血管內皮發揮保護作用，還需要進一步研究。

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(責任編輯：幸建華)

Effect of drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the ERK/Nrf2-HO-1 signaling pathway in Eahy926 cells

LYU Xiaohui1,SUN Jiayu1,CAI Zhigang1,ZHANG Ruipeng2,SHAN Aiyun1

(1.ShenzhenFutianDistrictTraditionalChineseMedicineHospital,Guangdong518033,China; 2.KeyLabforNewDrugsResearchofTCM,ShenzhenResearchInstituteofTsinghuaUniversity,Shenzhen518067,China)

Objective To investigate the effect of drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the ERK/Nrf2-HO-1 pathway in Eahy926 cells. Methods The proliferation of Eahy926 cells was detected by CCK-8 method. Western blotting was used to determine the protein expression of the ERK/Nrf2-HO-1 pathway. Results The drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promoted the proliferation of Eahy926 cells. The levels of ERK phosphorylation,Nrf2 nuclear translocation and HO-1 expression in Eahy926 cells treated with 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills were significantly higher than that of the control and blank groups. Conclusion 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promotes Nrf2 nuclear translocation and expression of HO-1 via inducing ERK phosphorylation.

Liuwei Dihuang pills; vascular endothelial cells; ERK/Nrf2-HO-1 signaling; protein expression

2016-05-10

深圳市科技研發基金(JCYJ20140414145007216)

呂小輝，女，主管藥師，主要從事臨床藥學研究，Email:22181265@qq.com；通信作者：單愛云，女，主任藥師，主要從事藥事管理研究，Email:253010652@qq.com。

時間：2016-09-30 9:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.0939.001.html

R285.5

A

1006-8783(2016)05-0618-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016051001