β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬和血清神經元特異性烯醇化酶變化的干預作用

劉得水　興桂華　盧長方　高志影　張曉杰

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬和血清神經元特異性烯醇化酶變化的干預作用

劉得水興桂華盧長方高志影張曉杰

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的探討抑郁模型大鼠海馬和血清神經元特異性烯醇化酶(NSE)變化及石菖蒲有效成分β-細辛醚的干預作用。方法采用慢性輕度不可預見性應激(CUMS)結合孤籠飼養建立穩定、可行的大鼠抑郁癥模型；運用曠場實驗進行行為學檢測；采用免疫組織化學檢測對大鼠海馬NSE表達量，應用ELISA方法測定血清NSE水平變化。結果與空白對照組大鼠比較，給予28 d的CUMS大鼠的自主活動得分減少，海馬區神經元NSE表達量減少(P<0.05)，但血清中NSE水平無顯著差異；給予陽性藥氟西汀(10 mg·kg-1·d-1)及β-細辛醚(25 mg·kg-1·d-1)均能顯著提高CUMS大鼠的自主活動得分，海馬CA3區神經元NSE表達量增多(P<0.05)，但對血清中NSE水平無影響。結論β-細辛醚具有明顯的抗抑郁作用，可能是通過提高神經元活性，減少神經元損傷，從而實現對CUMS大鼠神經的保護作用。

〔關鍵詞〕抑郁癥；β-細辛醚；神經元特異性烯醇化酶

抑郁癥(MDD)是一種復雜的異質性疾病。石菖蒲屬于醒腦開竅類中藥，有效成分主要為揮發油，β-細辛醚是揮發油的主要成分，被認為是其藥理作用的主要物質基礎，具有明顯的神經保護作用〔1〕。本實驗建立大鼠MDD模型，觀察β-細辛醚對給予慢性輕度不可預見性應激(CUMS)的大鼠腦海馬區神元特異性烯醇化酶(NSE)和血清NSE水平的影響，探討β-細辛醚對CUMS大鼠神經保護的作用機制。

1材料與儀器

1.1實驗動物SPF級SD大鼠80只，購買于哈爾濱醫科大學實驗動物醫學部，許可證編號：SCXK(黑)2013-0001。大鼠在動物房中適應環境7 d后開始進行實驗。

1.2試劑β-細辛醚(天津一方科技有限公司)；鹽酸氟西汀(上海中西制藥有限公司)。尼氏染色液(索萊寶科技有限公司)，anti-NSE antibody(EPITOMICS 公司)；免疫組化SP試劑盒(邁新生物技術有限公司)；NSE ELISA試劑盒(博海生物科技有限公司)。

1.3儀器CX41RBSF光學顯微鏡，PM-20型全自動顯微攝影儀，Tecan Safire2酶標儀。

1.4方法

1.4.1動物分組及給藥大鼠隨機分成4組：對照組：常規飼養；模型組：CUMS+生理鹽水；氟西汀組：CUMS+鹽酸氟西汀(10 mg·kg-1·d-1)；β-細辛醚組：CUMS+β-細辛醚組(25 mg·kg-1·d-1)，每組20只。對照組不給予藥物處理，其余各組在建模起分別口服或灌胃給予生理鹽水或相應藥物，1次/d，共28 d。

1.4.2建立CUMS抑郁模型對照組每5只大鼠一籠飼養，不給予任何刺激，自由飲水攝食。其余各組每籠飼養1只大鼠，每天隨機選用2種應激方式，持續28 d。應激方法參照文獻〔2〕并稍行改進，給予CUMS的大鼠單籠孤養，每周互換一次鼠籠。

1.4.3行為學檢測曠場實驗〔3〕，造模第29天，在安靜而且弱光環境下用曠場實驗法觀察記錄大鼠5 min內動作行為表現。

1.4.4免疫組織化學法檢測海馬NSE表達石蠟切片，脫蠟，脫苯水化；高壓修復；H2O2孵育；正常非免疫動物血清孵育；anti-NSE抗體，4℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌；二抗孵育，PBS洗滌；加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶孵育，PBS洗滌，DAB顯色，PBS終止顯色；復染，返藍，透明，封片；顯微鏡下觀察，采集圖片。

1.4.5酶聯免疫分析法檢測血清NSE將板內NSE孔內加入含NSEO的標準物100 μl，取樣品稀釋液50 μl加入樣品孔，孵育，洗板，甩干；加酶標抗體，洗板，甩干；加OPD液，顯色；終止反應。在酶標儀上于492 nm波長處檢測吸光度，根據標準曲線換算成實際NSE濃度(μg/L)。

1.5統計分析采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、SNK檢驗。

2結果

2.1β-細辛醚對CUMS大鼠行為學的影響持續給予28 dCUMS刺激之后，模型組大鼠與對照組大鼠相比表現出水平運動與垂直運動得分明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，β-細辛醚和氟西汀均能增加CUMS大鼠的水平運動與垂直運動得分(P<0.05)。見表1。

表1　β-細辛醚對CUMS大鼠曠場實驗垂直運動和

2.2β-細辛醚對海馬NSE蛋白表達影響持續給予28 d CUMS刺激之后，采用免疫組化技術檢測各組大鼠海馬NSE蛋白表達水平。結果顯示，與對照組(24.30±3.15)比較，模型組大鼠海馬NSE蛋白表達(10.09±3.56)減少(P<0.05)。與模型組比較，β-細辛醚(18.28±4.90)及陽性藥氟西汀(19.77±4.46)均可提高NSE蛋白表達(P<0.05)。

2.3β-細辛醚對CUMS大鼠血清NSE水平的影響持續給予28 d的UMS之后，與對照組〔(3.44±0.53)ng/L〕比較，模型組大鼠血清NSE水平〔(3.69±0.61)ng/L〕無顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比，給藥組大鼠血清NSE水平〔氟西汀組(3.42±0.64)ng/L，β-細辛醚組(3.51±0.82)ng/L〕也無顯著性差異(P>0.05)。

3討論

現代醫學研究發現，應激性生活事件是MDD發生的促發因素〔4〕，在一個新奇的環境中動物會產生類似焦慮的抑郁樣表現，動物的這種焦慮反應經抗抑郁藥物治療后可以有所緩解，表現為水平運動和垂直運動減少，因此，通過行為學實驗檢測可應用于抗抑郁藥物的篩選以及藥效的初步評價。本研究表明β-細辛醚能夠顯著改善CUMS大鼠的焦慮癥狀，具有明顯的抗抑郁作用。

NSE是烯醇化酶基因超家族的一員，可催化2-磷酸甘油酸到磷酸烯醇式丙酮酸的轉化，是糖酵解過程中的關鍵酶〔5〕。烯醇化酶主要由α、β、γ三個亞基組成的二聚體，而γ亞基特異性存在于神經元和神經來源的細胞中，故被命名為NSE〔6〕。NSE在正常體液中含量很低，在腦組織中分布最多〔7〕，已成為神經元損傷的特征性標志物。夏軍等〔8〕研究發現，抑郁模型大鼠NSE表達減弱，而經過藥物治療后大鼠的NSE表達增強，Abumaria等〔9〕發現使用抗抑郁劑能夠提高抑郁樣癥狀大鼠海馬NSE mRNA表達。通過本研究可以推測，β-細辛醚通過提高海馬神經元NSE表達，增加神經元的能量供應，從而對給予CUMS的大鼠起到神經保護作用。

4參考文獻

1Dong H，Gao Z，Rong H，etal.Beta-asarone reverses chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and promotes hippocampal neurogenesis in rats〔J〕.Molecules,2014;19(5)：5634-49.

2Autry AE，Adachi M，Nosyreva E，etal.NMDA receptor blockade at rest triggers rapid behavioural antidepressant responses〔J〕.Nature，2011;475(7354):91-5.

3Warner-Schmidt JL，Duman RS.VEGF is an essential mediator of the neurogenic and behavioral actions of antidepressants〔J〕.Proc Nat Acad Sci，2007;104(11):4647-52.

4趙幸福，徐一峰.生活事件與抑郁癥〔J〕.上海精神醫學，1995;7：209-11.

5Orlino EN，J Olmstead CE，Lazareff JA，etal.An enzyme immunoassay for neuron-specific enolase in cerebrospinal fluid〔J〕.Biochem Molecular Med，1997;61(1):41-6.

6Tracy MR，Hedges SB.Evolutionary history of the enolase gene family〔J〕.Gene，2000;259(1-2):129-38.

7Hein Nee Maier K，Kohler A，Diem R，etal.Biological markers for axonal degeneration in csf and blood of patients with the first event indicative for multiple sclerosis〔J〕.Neuroscience Letters，2008;436(1):72-6.

8夏軍，雷益，周義成.慢性應激大鼠抑郁癥模型的免疫組織化學和MRI研究〔J〕.武漢大學學報，2006;127(1)：83-6.

9Abumaria N，Rygula R，Hiemke C，etal.Effect of chronic citalopram on serotonin-related and stress-regulated genes in the dorsal raphe nucleus of the rat〔J〕.Eur Neuropsychopharmacol J Eur Coll Neuropsychopharmacol，2007;17(6-7):417-29.

〔2015-12-03修回〕

(編輯郭菁/滕欣航)

〔中圖分類號〕R749.4

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1040-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.007

通訊作者：張曉杰(1965-)，女，教授，博士生導師，博士，主要從事神經精神疾病的病理學研究。

基金項目：黑龍江省自然科學基金項目(H201354)

第一作者：劉得水(1981-)，男，助理實驗師，主要從事神經精神疾病的病理學研究。