新生血管、淋巴管在結直腸癌進展中的作用

張林西　郭　穎　白美玲

(河北北方學院生命科學研究中心，河北　張家口　075000)

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新生血管、淋巴管在結直腸癌進展中的作用

張林西郭穎白美玲

(河北北方學院生命科學研究中心，河北張家口075000)

〔摘要〕目的研究血管內皮生長因子(VEGF)、CD105、D2-40在結直腸癌中的表達及三者與結直腸癌患者臨床病理因素之間的相關性。方法收集結直腸癌標本99例及30例癌旁正常組織，應用免疫組織化學檢測VEGF、CD105、D2-40在以上標本中的表達，分析VEGF、CD105、D2-40的表達與結直腸癌患者臨床病理因素的相關性，以及三者協同表達情況。結果VEGF、CD105標記的微血管密度(MVD)值、D2-40標記的微淋巴管密度(LVD)值在癌組織中的表達均顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)；其表達與是否有淋巴結轉移均顯著相關(P<0.05)；結直腸癌中VEGF與CD105 、CD105與D2-40的表達均呈顯著正相關(P<0.05)。結論VEGF、CD105、D2-40可能在結直腸癌的發生進展過程中發揮重要作用；其高表達對結直腸癌的惡性程度及預后評估有一定的應用價值。

〔關鍵詞〕結直腸癌；免疫組織化學；血管內皮生長因子；微血管密度；微淋巴管密度

研究表明，血管生成和新生淋巴管的形成在腫瘤的浸潤轉移中起著重要作用〔1,2〕。血管內皮生長因子(VEGF)被認為是腫瘤血管新生最重要的調控因子之一，其在促進腫瘤生成、免疫逃脫、浸潤轉移及淋巴管的形成中發揮重要作用。CD105在腫瘤血管新生中也發揮重要作用，同時是腫瘤新生血管較好的標記物，標記效果強于CD34、CD31。D2-40是腫瘤淋巴管的特異標記物，不與血管內皮反應，只與新生淋巴管內皮細胞、微小淋巴管內皮細胞反應。本研究采用免疫組織化學方法，檢測VEGF在結直腸癌組織中的表達；選用CD105標記微血管密度(MVD)和D2-40標記微淋巴管密度(LVD)，分析在結直腸癌浸潤進展過程中，VEGF表達與血管新生、淋巴管新生的關系及與結直腸癌臨床病理因素之間的關系，旨在探討血管新生、淋巴管生成在結直腸癌發生發展中的作用。

1材料與方法

1.1標本收集收集河北北方學院附屬第一醫院2011年3月至2013年2月期間的結直腸癌標本99例、癌旁正常組織30例，患者術前均未進行任何放療、化療等治療。其中結腸癌40例，直腸癌59例；男53例，女46例；年齡<60歲40例，>60歲59例；組織分化程度：高、中分化腺癌83例，低分化腺癌16例；淋巴結無轉移55例，有轉移44例。

1.2主要試劑及方法兔抗人VEGF多克隆抗體、鼠抗人CD105單克隆抗體、鼠抗人D2-40單克隆抗體、PV9000二步法免疫檢測試劑盒等均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。所取標本常規處理、石蠟切片，常規HE染色。免疫組化采用高壓修復法，余均按說明書操作。

1.3結果判定以磷酸鹽緩沖液(PBS)液代替一抗作為陰性對照，以已知結直腸癌陽性切片作為陽性對照。由兩名病理學醫師在顯微鏡下進行雙盲閱片。

1.3.1VEGF的結果判定參照Jawhari等〔3〕的方法。400倍視野下隨機選取的5個不相重疊區域進行觀察，根據顯色程度與顯色數量分別計分。顯色程度：不顯色0分；淺黃色1分；黃色2分，棕黃色3分。顯色數量：(X=陽性細胞數)X<6%，0分；6%≤X<25%，1分；25%≤X<50%，2分；50%≤X<75%，3分；75%≤X，4分。取5個視野兩數值相乘的平均值，即為該切片計分。計分≤4，為陰性；4<計分，為陽性。

1.3.2CD105與D2-40的結果判定參照Weidner等〔4〕報道的方法，100倍鏡下選取管腔密度最高處，作為主要觀察區；400倍鏡下，于主要觀察區內隨機選取5個視野計數(染成棕褐色的單個內皮細胞、內皮細胞簇或直徑<8個紅細胞大小的管腔給予計數)，取平均值。

1.4統計學方法采用SPSS13.0統計軟件行χ2檢驗及秩和檢驗。各指標的相關性用Spearman相關分析法。

2結果

2.1VEGF的表達及其與臨床病理因素間的關系VEGF在癌旁正常組織中為細胞質呈淺黃色的陽性表達，而在結直腸癌組織中它的表達往往增強，呈黃色或棕黃色。正常黏膜組VEGF僅有36.7%(11/30)的陽性表達，而在結直腸癌組陽性表達率為66.7%(66/99)，組間比較有明顯差異(P<0.01)。VEGF陽性表達率與是否有淋巴結轉移、性別呈正相關(P<0.01)。但與患者的年齡、結直腸癌的分化程度及發生部位無關(P>0.05)。見表1。

2.2CD105的表達及其與臨床病理因素間的關系CD105在癌旁正常組織的血管內皮細胞中，表達較弱，MVD值較低(16.80)；而在結直腸癌組織中，CD105的表達增強，MVD值明顯增高(79.61)，差異顯著(P<0.01)。CD105標記的MVD值在有淋巴結轉移組(54.67)顯著高于無轉移組(44.16，P<0.05)；在高中分化組(52.70)顯著高于低分化組(36.00，P<0.05)。同時年齡≥60歲組MVD值(54.83)顯著高于年齡<60歲組(42.88，P<0.05)，女性組(58.27)高于男性組(42.82，P<0.05)，但與癌的發生部位無相關性(P>0.05)。

表1　VEGF表達與結直腸癌患者臨床病理因素的關系〔n(%)〕

與男性組比較：1)P<0.05；與有淋巴結轉移組比較：2)P<0.01

2.3D2-40的表達及其與臨床病理因素間的關系D2-40在癌旁正常組織的淋巴管內皮細胞中，為弱陽性表達，LVD值較低(42.22)；而在結直腸癌組織中，D2-40的表達增強，LVD值增高(71.90)，差異顯著(P<0.01)。D2-40標記的LVD值在有淋巴結轉移組(73.56)顯著高于無淋巴結轉移組(42.76，P<0.05)。但與患者的年齡、性別、癌的分化程度及發生部位等無明顯相關性(P>0.05)。

2.4VEGF、CD105、D2-40表達的相關性VEGF蛋白與CD105蛋白的表達之間呈顯著正相關(r=0.200，P=0.047)，CD105與D2-40的表達呈顯著正相關(r=0.234，P=0.019)，VEGF與D2-40的表達之間無顯著相關性(r=-0.078，P=0.442)。

3討論

VEGF與CD105均可促進腫瘤新生血管的形成，在腫瘤的生長與血行轉移中發揮重要作用；VEGF還可以促進腫瘤淋巴管的新生，在腫瘤的淋巴轉移中發揮重要作用；CD105 也是新生腫瘤血管常用標記物，只表達于正在進行分裂增殖的新生血管內皮，標記效果強于CD34、CD31；D2-40能特異標記腫瘤淋巴管。本研究發現，VEGF、CD105、D2-40在癌旁正常組織中表達均較弱，而在癌中表達均增強；VEGF、CD105、D2-40在無淋巴結轉移癌中的表達均較弱，在有淋巴結轉移的癌中表達均增強。說明VEGF、CD105和D2-40在結直腸癌的生長與轉移中發揮重要作用。

VEGF、CD105通過促進腫瘤血管的生成進而促進腫瘤的生長，同時促進腫瘤的血行轉移。腫瘤需要大量的營養物質與氧氣才能生長，它們主要由腫瘤新生血管提供。若無新生血管形成，當腫瘤直徑>2~3 mm，腫瘤中心就會萎縮、壞死。而沒有新生血管的形成，腫瘤也無法完成血行轉移。VEGF是血管生成的關鍵調節因子；它通過與其受體結合，激發系列反應，促進血管內皮增殖，增加微血管通透性，降解細胞外基質，最后導致腫瘤新生血管的形成。CD105又稱Endoglin，是轉化生長因子β受體復合物的重要組成成分之一，它參與了腫瘤血管新生的重要信號的傳遞過程。CD105在多種惡性腫瘤均有表達，其表達強度與惡性程度或術后復發率正相關〔5，6〕。有研究發現，在結直腸腺瘤由輕度、重度不典型增生至腺癌發展的過程中，CD105標記的MVD值逐漸升高，表明CD105預測結直腸腺瘤癌變的有效指標，提示CD105有助于早期診斷疾病。CD105在多數腫瘤組織中表達明顯增強，且與預后相關〔7，8〕。

腫瘤轉移主要途徑除血行轉移外，還有淋巴轉移；新生淋巴管的形成是淋巴轉移的核心環節。VEGF與其受體結合后也能促進新生淋巴管的形成。D2-40能特異標記腫瘤淋巴管。D2-40抗體作為抗癌胚抗原M2A的IgG2a型鼠源性單克隆抗體，最初是從胎兒的睪丸和生殖細胞腫瘤中發現的。M2A表達于腫瘤新生淋巴管內皮細胞與幼稚毛細淋巴管內皮細胞，而不表達于血管內皮 。D2-40檢測的特異性和敏感度均高于其他分子標記物〔9，10〕。現在認為，病灶中的LVD反映腫瘤淋巴管生成狀態，與腫瘤的分期和淋巴結轉移有關〔11〕。郝秀輕等〔12〕研究發現食管癌周邊區淋巴管明顯高于中心區和正常組織。

本研究發現，VEGF表達的陽性率及CD105標記的MVD值均與性別相關，未見文獻報道。VEGF在男性表達的陽性率高于女性，男性CD105標記的MVD值明顯低于女性，提示男女體內的某些差別(如雌激素水平)，可能是造成VEGF與CD105表達差異的原因。CD105標記的MVD值與患者年齡呈正相關，提示隨著年齡增加維持腫瘤生長所需的血管數也在增加。

VEGF可以促進腫瘤血管與淋巴管的新生，腫瘤血管的新生可以促進腫瘤的生長和血行轉移，淋巴管的新生可以促進腫瘤的淋巴轉移〔13〕。腫瘤的分期越高，VEGF、CD105、D2-40的表達越強，可見VEGF、CD105、D2-40在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用。

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〔2014-09-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

〔中圖分類號〕R735

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1116-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.043

基金項目：河北省高等學校科學技術研究重點項目(No.ZD20131004)

第一作者：張林西(1968-)，男，教授，博士，主要從事消化道腫瘤研究。