萊菔硫烷對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)和白介素-1β水平的影響

孟鑫雨　費(fèi)洪新　王少東　趙瑤潔　王曉源　羅麗娜　劉　旭　彭東軍　周忠光　李寶龍

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江　哈爾濱　150040)

?

·基礎(chǔ)研究·

萊菔硫烷對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)和白介素-1β水平的影響

孟鑫雨費(fèi)洪新1王少東趙瑤潔王曉源羅麗娜劉旭彭東軍周忠光李寶龍

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

〔摘要〕目的探討萊菔硫烷(SFN)對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)和白介素(IL)-1β水平的影響。方法42只Wistar大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組，模型組，治療組(吡拉西坦430 mg/kg)，SFN高、中、低劑量組(SFN 40，20，10 mg/kg)。采用Aβ(1～42)雙側(cè)腦室注射大鼠誘導(dǎo)建立AD模型。給予SFN連續(xù)灌胃治療35 d后取材，觀察大鼠海馬鏡下超微結(jié)構(gòu)、計(jì)算脾和胸腺臟器指數(shù)，采用雙抗體夾心法測定海馬組織IL-1β水平。結(jié)果與模型組比較，SFN高、中劑量組腦海馬形態(tài)明顯改善，脾和胸腺臟器指數(shù)明顯增加(P<0.05)，海馬組織IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論SFN能改善AD大鼠海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加脾和胸腺臟器指數(shù)，降低海馬組織IL-1β水平。

〔關(guān)鍵詞〕萊菔硫烷；阿爾茨海默??；超微結(jié)構(gòu)

阿爾茨海默病(AD)是臨床上常見的老年性疾病之一，目前抗AD的藥物僅僅是短暫改善AD患者的癥狀，對(duì)AD病情的發(fā)展并沒有較大的影響〔1〕。中藥材西蘭花、芥藍(lán)、花椰菜等植物中含有萊菔硫烷(SFN)。SFN又稱為蘿卜硫素，分子式為C6H11S2NO，具有內(nèi)源性抗氧化〔2〕、抗視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷〔3〕、抑制前列腺癌DU145細(xì)胞增殖〔4〕、改善線粒體功能〔5〕、預(yù)防精神病發(fā)作〔6〕、保護(hù)AD大鼠膽堿能神經(jīng)元〔7〕等功能，但SFN對(duì)Aβ1～42誘導(dǎo)AD大鼠模型的研究國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬觀察SFN對(duì)AD大鼠超微結(jié)構(gòu)、臟器指數(shù)和白介素(IL)-1β的影響，以期為防治AD奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1動(dòng)物雄性清潔級(jí)Wistar大鼠42只，體重(230±20)g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心李寶龍副主任提供，質(zhì)量合格證書號(hào)：SCXK(黑)2013-012。Wistar大鼠飼養(yǎng)在常溫、常濕的屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施環(huán)境中，給予Wistar大鼠無菌的飼料和蒸餾水，自由攝取食物、分籠飼養(yǎng)。

1.2藥品和試劑吡拉西坦(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，批號(hào)5140556)，IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20140401)，Aβ1～42和D-半乳糖(Sigma公司)，SFN(LKT公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心李寶龍副主任提供。

1.3儀器TCNAI-G2型透射電鏡(荷蘭公司)，TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，Leica-2135切片機(jī)(德國Leica公司)，電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)，6100型RT-雷杜酶標(biāo)儀(美國RT公司)，STW-1型腦立體定位儀(成都儀器廠)等。

1.4復(fù)制AD模型大鼠水合氯醛麻醉后，固定大鼠，剪去大鼠頭頂部毛發(fā)，暴露頂骨，STW-1型腦立體定位儀定位大鼠海馬區(qū)，微量加樣器向雙側(cè)腦室海馬區(qū)一次性注入10 μg凝聚態(tài)Aβ1～42(2 μg/μl)，針頭留置15 min，緩慢退針，骨蠟封閉，包扎大鼠頭部，預(yù)防感染。對(duì)照組大鼠雙側(cè)腦室注射等量生理鹽水。

1.5分組及給藥Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組、SFN高劑量組、SFN中劑量組、SFN低劑量組，每組7只，共42只。對(duì)照組和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，治療組給予吡拉西坦430 mg/kg灌胃，SFN高、SFN中、低劑量組分別給予40、20、10 mg/kg灌胃，持續(xù)35 d。

1.6透射電鏡觀察腦組織海馬大鼠末次給藥2h后，水合氯醛麻醉，剪開腹腔、胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，針頭插入左心室，向左心室緩慢灌注200ml生理鹽水。肝臟變白后，用2.5%戊二醛灌注，取材大鼠腦組織海馬部位、2.5%戊二醛固定、四氧化鋨固定、脫水、包埋、切片等過程，TCNAI-G2型透射電鏡觀察大鼠腦組織海馬CA3區(qū)結(jié)構(gòu)。

1.7測定脾和胸腺臟器指數(shù)大鼠斷頭處死，冰上迅速解剖，取材大鼠脾和胸腺，用生理鹽水將臟器清洗干凈，洗去殘余的血液，用電子天平精確稱取大鼠脾和胸腺的臟器質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(mg/g)=臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.8檢測海馬白介素(IL)-1β含量大鼠斷頭迅速取海馬組織，勻漿，4℃靜置1 h，TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)4 000 r/min離心30 min，分裝，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按說明書進(jìn)行操作，使用6100型RT-雷杜酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定各孔吸光度(A)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出海馬組織IL-1β的含量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1SFN對(duì)AD大鼠腦海馬CA3區(qū)超微結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1SFN對(duì)AD大鼠腦海馬CA3區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核橢圓形，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的比例正常，核膜清晰；模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核扁圓形，細(xì)胞質(zhì)較少，核染色質(zhì)邊集，核膜不清楚；治療組、SFN高、中和低劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器不同程度地增加。見圖1。

2.1.2SFN對(duì)AD大鼠腦海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)比較豐富，可以見到雙層核膜，核膜清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)較少，內(nèi)外層核膜不清楚，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少；治療組、SFN高、中和SFN低劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器不同程度地增加，核膜較清晰。見圖2。

2.1.3SFN對(duì)AD大鼠腦海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組大鼠海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管形態(tài)規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞核扁圓形，管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞；模型組大鼠海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核不清晰，細(xì)胞質(zhì)較少，毛細(xì)血管管壁較厚且分層不清晰；治療組、SFN高和中劑量組大鼠海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管形態(tài)較為規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞清晰，說明SFN高、中劑量對(duì)AD大鼠海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管有改善作用；SFN低劑量組大鼠海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管管壁結(jié)構(gòu)分層不清晰，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰。見圖3。

2.1.4SFN對(duì)AD大鼠腦海馬CA3區(qū)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元突觸豐富，突觸不融合；模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元突觸較少，突觸間隙不清楚，突觸融合；治療組、SFN高、中和SFN低劑量組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元突觸不同程度地增加。見圖4。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：治療組；D：SFN高劑量組；E：SFN中劑量組；F：SFN低劑量組；下圖同圖1　SFN對(duì)AD大鼠腦海馬CA3區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響(透射電鏡，×2 550)

圖2　SFN對(duì)AD大鼠腦海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的影響(透射電鏡，×11 500)

圖3　SFN對(duì)AD大鼠腦海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)的影響(透射電鏡，×11 500)

圖4　SFN對(duì)AD大鼠腦海馬CA3區(qū)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)的影響(透射電鏡，×20 500)

2.2SFN對(duì)AD大鼠脾和胸腺臟器指數(shù)的影響與對(duì)照組相比，模型組大鼠脾和胸腺臟器指數(shù)明顯降低(P<0.05)；經(jīng)過治療后，與模型組比較，治療組、SFN高、中劑量組脾和胸腺臟器指數(shù)明顯升高(P<0.05)；而與模型組比較，低劑量組脾和胸腺臟器指數(shù)改變不明顯(P>0.05)。見表1。

表1　SFN對(duì)AD大鼠脾和胸腺臟器指數(shù)的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.3SFN對(duì)AD大鼠腦海馬IL-1β含量的影響與對(duì)照組〔(235.16±39.05)pg/ml〕比較，模型組大鼠海馬組織IL-1β含量〔(385.34±53.39)pg/ml〕明顯升高(P<0.05)；經(jīng)過治療后，與模型組比較，治療組〔(262.82±62.73)pg/ml〕、SFN高劑量組〔(286.33±66.00)pg/ml〕、SFN中劑量組〔(295.64±70.47)pg/ml〕大鼠海馬組織IL-1β含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組大鼠海馬組織IL-1β的含量〔(347.73±79.83)pg/ml〕改變不明顯(P>0.05)。

3討論

AD神經(jīng)元病變的區(qū)域主要集中在海馬、皮質(zhì)等〔8〕。海馬結(jié)構(gòu)主要分為CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)，其中CA3區(qū)與學(xué)習(xí)記憶關(guān)聯(lián)度較大〔9〕。國外的學(xué)者較多采用海馬區(qū)域注射Aβ1～42誘導(dǎo)AD模型〔10～12〕，國內(nèi)的研究者多采用海馬區(qū)域注射Aβ1～42及腹腔注射D-半乳糖建立AD模型〔13〕。本實(shí)驗(yàn)說明SFN可以改善AD大鼠海馬CA3區(qū)的超微結(jié)構(gòu)。

外周免疫器官脾臟產(chǎn)生大量的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌抗體，參與機(jī)體的體液免疫；而中樞免疫器官胸腺可產(chǎn)生大量的T細(xì)胞和胸腺素，提示其可參與機(jī)體的細(xì)胞免疫。脾臟和胸腺的相對(duì)質(zhì)量增加或者減少可間接顯示機(jī)體免疫功能的增強(qiáng)或者減弱。本實(shí)驗(yàn)提示模型組大鼠脾和胸腺相對(duì)質(zhì)量減輕，說明模型組大鼠B細(xì)胞和T細(xì)胞數(shù)量減少，提示模型組免疫功能降低。SFN可以增加脾臟和胸腺的相對(duì)質(zhì)量，增加機(jī)體的免疫功能，而說明低劑量SFN對(duì)AD大鼠的免疫功能影響不明顯。

在AD中β淀粉樣蛋白可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β，IL-1β可以作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，從而釋放更多的IL-1β；另外，IL-1β可以作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞的IL-1β受體，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎癥介質(zhì)，參與機(jī)體腦組織無菌性的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠海馬區(qū)域無菌性炎癥反應(yīng)明顯。SFN高、中劑量可以改善腦組織海馬的神經(jīng)性炎癥反應(yīng)，但低劑量SFN對(duì)大鼠海馬區(qū)域IL-1β水平的影響不明顯。本實(shí)驗(yàn)顯示IL-1β的變化趨勢與AD大鼠海馬CA3區(qū)結(jié)構(gòu)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的變化趨勢相互關(guān)聯(lián)，大鼠海馬IL-1β含量降低可伴隨著大鼠海馬CA3區(qū)結(jié)構(gòu)改善，說明SFN可以通過降低大鼠海馬IL-1β含量來改善大鼠海馬的超微結(jié)構(gòu)。

綜上所述，SFN可以改善AD大鼠海馬CA3區(qū)超微結(jié)構(gòu)，增加AD大鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，增強(qiáng)AD大鼠的免疫功能，減輕AD大鼠的癥狀，保護(hù)AD大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)，SFN防治AD的機(jī)制與降低海馬IL-1β含量有關(guān)。

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〔2015-09-24修回〕

(編輯郭菁)

Effects of sulforaphane on ultrastructure and IL-1β of hippocampal in Alzheimer's disease rat

MENG Xin-Yu，WANG Shao-Dong，ZHAO Yao-Jie，etal.

Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040,Heilongjiang,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of sulforaphane(SFN)on ultrastructure and IL-1β of hippocampal in Alzheimer's disease(AD)rat.MethodsWistar rats were randomly divided into control，model，treatment(Piracetam 430 mg/kg)，SFN high-dose(40 mg/kg)，middle-dose(20 mg/kg)，low-dose(10 mg/kg)groups.Aβ(1～42) was injected into the bilateral hippocampal of rat to induce AD models.The rats were killed after 35 days continuous treating.After the treatment,all animals were sacrificed，ultrastructure of hippocampal was observed，calculated the organ coefficients of splenic and thymus.Biochemical methods were used to test the content of IL-1β.ResultsCompared with that of model group，the brain maintain normal morphological structure of hippocampal in SFN high-dose and medial-dose groups was significantly increased，the organ coefficients of splenic and thymus significantly were increased(P<0.05)，the level of IL-1β of hippocampal tissue were significantly decreased(P<0.05).ConclusionsSFN could maintain normal morphological structure of hippocampal of AD rat，increase organ coefficients of splenic and thymus，decrease IL-1β responses in the hippocampal tissue.

【Key words】Sulforaphane；Alzheimer′s disease；Ultrastructure

〔中圖分類號(hào)〕R285

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)06-1281-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.001

通訊作者：李寶龍(1973-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦老化、癡呆、痛風(fēng)和肝纖維化研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81573135，81373777，81173599)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(12541763)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題(博導(dǎo)類，20132327110010)

1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院

第一作者：孟鑫雨(1989-)，男，在讀碩士，主要從事腦老化、癡呆、痛風(fēng)和肝纖維化研究。