補腎解毒通絡方對EAE大鼠CD4+、CD8+ T細胞和IL-17的影響

趙　鐸　王　丹　崔名雯　齊亞莉

(河南中醫學院第一附屬醫院腦病科，河南　鄭州　450000)

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補腎解毒通絡方對EAE大鼠CD4+、CD8+T細胞和IL-17的影響

趙鐸王丹崔名雯1齊亞莉2

(河南中醫學院第一附屬醫院腦病科，河南鄭州450000)

〔摘要〕目的探討補腎解毒通絡方對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠外周血CD4+、CD8+T細胞和腦組織內白細胞介素(IL)-17的影響。方法將60只雌性Wistar大鼠按照隨機數字表法分為空白對照組(正常)、模型對照組(EAE+生理鹽水)、低劑量組(EAE+15 g·kg(-1)·d(-1))、中劑量組(EAE+30 g·kg(-1)·d(-1))及高劑量組(EAE+60 g·kg(-1)·d(-1))。模型建立后持續灌胃14 d。治療結束后，采用流式細胞術檢測大鼠外周血CD4+、CD8+ T細胞水平，采用免疫組織化學方法和陽性細胞計數檢測各組大鼠側腦室周圍組織內IL-17水平。結果(1)與空白對照組相比，模型對照組大鼠CD4+、CD4+/CD8+明顯偏高，CD8+明顯偏低(P<0.05)；與模型對照組、低劑量組及中劑量組相比，高劑量組大鼠CD4+、CD4+/CD8+明顯偏低，CD8+明顯偏高(P<0.05)；高劑量組與空白對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。(2)與空白對照組相比，模型對照組大鼠IL-17陽性細胞數明顯偏高(P<0.05)；與模型對照組、低劑量組相比，中劑量組和高劑量組明顯偏低(P<0.05)；高劑量組與空白對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論補腎解毒通絡方60 g/kg劑量能更好地升高EAE大鼠外周血CD8+ T細胞同時降低CD4+ T細胞和IL-17陽性細胞數。

〔關鍵詞〕補腎解毒通絡方；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；CD4+ T細胞；CD8+ T細胞；白細胞介素-17

實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是人類多發性硬化(MS)疾病的理想動物模型，被廣泛用于研究MS的發病機制和治療〔1〕。MS是一種中樞神經系統的自身免疫性疾病，T淋巴細胞在自身免疫性疾病中發揮重要的作用，能夠直接表征疾病的發生和發展〔2〕。IL-17由CD4+T細胞分泌，能夠誘導上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞合成分泌IL-6和IL-8，在自身免疫性疾病中的重要性受到越來越多的關注〔3〕。近年來研究發現，補腎解毒通絡方具有改善MS患者臨床癥狀和降低副反應的作用，價格便宜〔4〕。本研究旨在探討補腎解毒通絡方對EAE大鼠外周血CD4+、CD8+T細胞和腦組織IL-17的影響。

1資料與方法

1.1實驗動物及藥物雌性Wistar SPF級大鼠60只，5～7周齡，體重(182.1±11.3)g，購自廣西醫科大學動物實驗中心。飼養環境：溫度22℃、相對濕度60%～70%、每日光照時間12 h。補腎解毒通絡方為淫羊藿15 g、巴戟天15 g、菟絲子15 g、重樓15 g、六月雪15 g、全蝎10 g、僵蠶15 g、黃芪30 g、澤瀉15 g、川芎20 g、皂刺12 g、莪術12 g、甘草6 g。依照中藥傳統方法煎煮，制備成0.5 g/ml的溶液，分裝，4℃保存備用。

1.2主要儀器及試劑手動勻漿機，購自上海玻璃儀器廠；Cr60型電熱恒溫水浴鍋，購自廣東汕頭醫用設備廠；80-1型離心機，購自上海手術器械廠；XD-202型倒置顯微鏡，購自南京江南永新光學有限公司；FACS Calibur 流式細胞儀，購自美國BD公司。百日咳疫苗原漿液(3.0×1010/ml)，購自上海生物制品研究所；完全弗式佐劑，購自美國sigma公司；CD4-FITC(異硫氰酸熒光素)抗體和CD8-PE(藻紅蛋白熒光素)抗體，購自天津三箭生物公司；鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)免疫組織化學試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒，購自武漢博士德生物公司。

1.3EAE大鼠模型的建立依照相關文獻〔5，6〕，于Wistar大鼠雙后肢足底處按0.2 ml/100 g劑量皮下注射免疫抗原，在右后肢足背處按0.2 ml/只劑量皮下注射百日咳疫苗原漿液。建模后每日觀察大鼠發病情況，在大鼠出現食欲不振、體重減輕、精神萎靡、四肢無力甚至癱瘓等情況，判定EAE模型建立成功。

1.4實驗動物分組及干預措施將60只雌性Wistar大鼠按照隨機數字表隨機分為5組各12只，空白對照組：正常Wistar大鼠，未采取任何處理；模型對照組：建立EAE模型，建模后每天灌胃給予2 ml生理鹽水，持續14 d；低劑量組：建立EAE模型，建模后每天灌胃給予補腎解毒通絡方，15 g/kg，持續14 d；中劑量組：建立EAE模型，建模后每天灌胃給予補腎解毒通絡方，30 g/kg，持續14 d；高劑量組：建立EAE模型，建模后每天灌胃給予補腎解毒通絡方，60 g/kg，持續14 d。

1.5檢測指標治療結束后，采集各組大鼠外周血，采用流式細胞儀檢測大鼠CD4+、CD8+T細胞的表達水平。用免疫組織化學方法計數各組大鼠腦組織切片中的IL-17陽性細胞。

1.6統計學方法使用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1各組治療后CD4+、CD8+T細胞比較與空白對照組相比，模型對照組大鼠CD4+、CD4+/CD8+明顯偏高，CD8+明顯偏低(P<0.05)；與模型對照組、低劑量組及中劑量組相比，高劑量組大鼠CD4+、CD4+/ CD8+明顯偏低，CD8+明顯偏高(P<0.05)；高劑量組與空白對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組治療后IL-17水平比較治療后，空白對照組大鼠側腦室周圍IL-17陽性細胞數為(1.41±0.47)個，模型對照組為(25.23±7.15)個，低劑量組為(23.45±9.57)個，中劑量組為(10.18±4.36)個，高劑量組為(2.57±1.01)個。與空白對照組相比，模型對照組明顯偏高(P<0.05)；與模型對照組、低劑量組相比，中劑量組和高劑量組明顯偏低(P<0.05)；高劑量組與空白對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1　各組治療后CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+比較

與空白對照組比較：1)P<0.05；與高劑量組比較：2)P<0.05

3討論

臨床上對MS的治療多采用免疫抑制劑或激素療法，病殘率較高，預后差，價格高昂〔7〕。近年來研究發現，補腎解毒通絡方對MS有較好的療效，其不同成分能通過不同機制調節內分泌和免疫功能，增強機體的特異細胞免疫和體液免疫功能，提高患者的機體免疫力。EAE和人類MS具有相似的免疫、生化、病理和臨床特征，是人類MS疾病的理想動物模型。本研究結果提示補腎解毒通絡方60 g/kg能夠明顯降低EAE大鼠的外周血CD4+T細胞水平，升高外周血CD8+水平，具有調節機體T淋巴細胞、改善免疫功能的作用，可改善EAE癥狀。這可能是由于補腎解毒通絡方中的藿香對免疫性炎癥都有一定的抑制作用，而茯苓具有免疫調節、保護血管內皮的作用，它們從不同方面來調節機體CD4+、CD8+T細胞水平，使機體免疫功能得到改善〔8〕。有文獻報道〔9〕，IL-17的表達部位主要為炎性細胞，也有少量表達于膠質細胞和神經元，IL-17在炎癥反應嚴重的區域高表達，而在嚴重反應輕的部位低表達甚至不表達。本研究結果提示補腎解毒通絡方30 g/kg、60 g/kg均就能明顯使EAE大鼠腦組織的IL-17水平低表達。這主要與補腎解毒通絡方中的茯苓、澤瀉等成分發揮的抗感染作用有關〔10〕。

4參考文獻

1王彥月，張艷，秦新月，等.改良Wistar大鼠EAE模型的建立及其評價〔J〕.中國實驗診斷學，2012；16(1)：8-11.

2董梅，劉瑞春，郭力，等.胸腺細胞凋亡在EAE模型中的變化〔J〕.免疫學雜志，2011；27(3)：221-4.

3Sasaki K，Bean A，Shah S，etal.Relapsing-remitting central nervous system autoimmunity mediated by GFAP-specific CD8 T cells 〔J〕.J Immunol，2014；192(7)：3029-42.

4袁宏宇，董梅，劉瑞春，等.EAE大鼠臨床病變與胸腺損傷關系探討〔J〕.免疫學雜志，2011；27(5)：459-62.

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7Solchaga LA，Zale EA.Prostaglandin E2：a putative potency indicator of the immunosuppressive activity of human mesenchymal stem cells〔J〕.Am J Stem Cells，2012；1：138.

8申張順，高倩，程樹彬，等.胸腺切除對EAE大鼠發病影響及機制的探討〔J〕.中風與神經疾病雜志，2013；30(10)：916-9.

9Weiss JM，Bilate AM，Gobert M，etal.Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells，but not mucosa-generated induced Foxp3+T reg cells〔J〕.J Exp Med，2012；209(10)：1723-42.

10Luz-Crawford P，Kurte M，Bravo-Alegria J，etal.Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells 〔J〕.Stem Cell Res Ther，2013；4(3)：65.

〔2015-08-03修回〕

(編輯滕欣航)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1298-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.008

基金項目：河南省中醫藥管理局重點中醫學科(專科)學術帶頭人培養項目專項課題(2013ZY03005)；河南省中醫藥科學研究專項課題(2013ZY02012)；鄭紹周全國名老中醫藥專家傳承工作室建設項目(國中醫藥人教函〔2012〕149號)

1河南鞏義市人民醫院神經內科2河南濟源職業技術學院護理系

第一作者：趙鐸(1973-)，女，副主任醫師，主要從事中西醫結合治療多發性硬化方面的研究。