基質交感分子1介導鈣離子內流對老年冠心病患者外周血T細胞亞群激活的影響

郜　攀　龍　軍　王　端　司良毅

(第三軍醫大學第一附屬醫院老年病科，重慶　400038)

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基質交感分子1介導鈣離子內流對老年冠心病患者外周血T細胞亞群激活的影響

郜攀龍軍王端司良毅

(第三軍醫大學第一附屬醫院老年病科，重慶400038)

〔摘要〕目的探討基質交感分子(Stim)1介導鈣離子(Ca(2+))內流對老年冠心病患者外周血T細胞亞群激活的影響。方法采集2013年1～12月在第三軍醫大學第一附屬醫院的患者共125例，根據冠狀動脈造影(CAG)結果分成對照組和冠心病組，采集所有患者基礎臨床生化指標。采用流式細胞計數分析患者T淋巴細胞數目，免疫磁珠法分離患者外周血CD3+T淋巴細胞，采用Western印跡法檢測T細胞內Stim1蛋白表達，采用免疫熒光法檢測T細胞內Ca(2+)內流，ELISA法檢測外周血炎癥因子水平。結果與對照組比較，冠心病組患者年齡、體質量指數(BMI)、高血壓史、吸煙史、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、N-端腦鈉肽前體(NT-proBNP)和胱抑素C水平均顯著增高(P<0.05)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平顯著降低(P<0.05)；與對照組比較，冠心病患者CD3+T以及CD4+T細胞數目顯著增加(P<0.05)，而CD8+T細胞和調節型T細胞(CD4+Foxp3+，Treg)顯著降低(P<0.05)。體外培養患者的T淋巴細胞中，與對照組比較，冠心病組T細胞內Stim1蛋白表達顯著增高(P<0.05)，T細胞Ca(2+)內流顯著增加；與對照組比較，冠心病患者外周血中白細胞介素(IL)-12、干擾素(IFN)-γ和IL-6水平均顯著增高(P<0.05)，而轉化生長因子(TGF)-β水平顯著降低(P<0.05)。結論冠心病患者T細胞Stim1表達水平增高，Stim1可通過調節Ca(2+)內流進而影響T淋巴細胞亞群活性，促進動脈粥樣硬化的進展。

〔關鍵詞〕基質交感分子1；鈣離子；冠心病；T細胞

近年來，免疫反應在冠心病發生發展過程中的作用逐漸被認知。其中，T 淋巴細胞在粥樣斑塊的進展中發揮著重要的作用〔1〕。研究表明，鈣離子(Ca2+)內流在T細胞激活中發揮重要作用，持續的Ca2+內流作為第二信使可激活T細胞〔2,3〕。本研究擬探討Ca2+內流對T細胞亞群激活的影響及其作用機制。

1對象與方法

1.1對象采集2013年1～12月在第三軍醫大學第一附屬醫院的冠心病患者共125例。所有入選患者行冠狀動脈造影(CAG)檢查。冠心病診斷符合AHA/ACC指南冠心病診斷標準，經CAG證實至少有一支冠狀動脈內徑狹窄≥50%〔4〕。經CAG明確冠心病患者64例，非冠心病患者(對照組)61例。排除標準：超聲心動圖提示左室功能不全；心功能Ⅲ～Ⅳ級；既往曾行CAG診斷為冠心病或長期服用阿司匹林或氯吡格雷抗血小板治療；長期服用他汀類藥物降脂治療；既往有明確的風心病或老年退行性心臟瓣膜病；慢性腎功能不全患者。所有患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1臨床基本資料收集記錄所有入選者性別、年齡、身高、體重、體重指數(BMI)、收縮壓、舒張壓。取空腹靜脈血，檢測血脂、肌酐、空腹血糖、腦鈉肽(BNP)等指標。

1.2.2外周血處理用含有2%EDTA的無菌促凝管收集患者外周血2 ml，加入紅細胞裂解液2 ml后輕柔搖勻，4℃ 400 r/min離心，重復3次，每次均棄除上清，以無菌PBS水沖洗。最后用5%胎牛血清RPMI1640培養基5 ml懸浮細胞。

1.2.3流式細胞計數取100 ml懸浮的細胞鋪在96孔板，以1 200 r/min離心5 min，使細胞沉淀在孔底。加入20 μl Fc抗體阻斷非特異性染色，以PBS緩沖液(1 L PBS、1%BSA和0.05%疊氮鈉)稀釋抗體至1∶100。加入20 μl一抗孵育20 min后，用PBS緩沖液沖洗各孔，準備進行FOXP3染色。將細胞用調節T細胞染色試劑盒中的固定緩沖液50 μl加入每孔，在4℃下孵育20 min。用穿孔緩沖液稀釋Treg抗體后，將抗體加入96孔板，每孔在4℃下孵育30 min。最后用穿孔緩沖液沖洗1次，并以0.3多聚甲醛固定過夜。第2天用PBS沖洗多聚甲醛，送檢流式細胞儀。抗體購于ABCAM公司，檢測T細胞亞群時采用FITC-CD3、Pacific Blue-CD4、APC-CD8抗體，觀察調節型T細胞(Tregs)采用APC-CD4，Foxp3-Pacific Blue。

1.2.4外周血T淋巴細胞分離免疫磁珠法分離CD3+T淋巴細胞。CD3+T細胞磁珠購自德國Miltenyi Biotech公司。取適量磁珠懸液，用20倍體積的PBS+0.2%BSA溶液重懸后，置磁架上5 min(磁珠與單個核細胞或全血的比例為0.5 mg磁珠/1×107個單個核細胞或1 ml全血)。吸去上清，以去除在儲存過程中從磁珠上脫落的二抗。用100 μl PBS+0.2%BSA溶液重懸磁珠。加入一抗(一抗與磁珠的比例：5 μg一抗/1 mg磁珠)，置室溫15 min，中間輕微晃動二次。再置磁架上5 min。加入2 ml PBS+1.2%BSA溶液，再置磁架上5 min。吸去上清，以去除未與二抗結合的一抗。重復操作一次。用100 μl PBS+0.2%BSA溶液重懸磁珠。用PBS+30%FCS調整待分離細胞的濃度為1×107細胞/ml，將細胞加入磁珠懸液中，置室溫10 min，中間輕微晃動一次，然后置磁架上10 min，吸去上清。用完全培養基重懸磁珠結合的細胞后直接進行培養。

1.2.5T細胞蛋白含量的檢測采用Western印跡法檢測T細胞內Stim1蛋白表達。采用細胞裂解液提取T細胞胞質蛋白。胞質蛋白經考馬斯亮藍蛋白定量后點樣100 μg/孔,行10%SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳,待電泳完畢電轉移至硝酸纖維素濾膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗為1∶200山羊抗人Stim1抗體;4℃過夜。二抗為HRP標記抗山羊IgG，室溫1 h，漂洗后將DAB顯色。

1.2.6T細胞Ca2+內流的檢測按照參考文獻〔5〕中熒光檢測方法進行，將各組分離后T淋巴細胞接種于放有圓形玻片的小培養皿中，24 h后將玻片取出放入灌流槽中，Fura-2/AM 37℃孵育細胞 30 min后去酯化，用含2 mmol/L Ca2+的PBS溶液沖洗3遍后將灌流槽放于倒置熒光顯微鏡上，用340 nm與380 nm波長的激發光激發Ca2+熒光探針Fura-2/AM發射熒光，拍攝并分析，每10 s拍攝一次熒光照片，并記錄熒光值，得出兩個激發光的熒光強度比值的變化(即Δratio)，反映〔Ca2+〕i。

1.2.7外周血炎癥因子檢測取2 ml靜脈血，12 000 r/min離心12～15 min，吸取上層液體。采用商用的ELISA試劑盒分別檢測細胞炎癥因子白介素(IL)-4、IL-12、干擾素(IFN)-γ、IL-6和轉化生長因子(TGF)-β水平。

1.3統計學分析應用SPSS19.0軟件計量資料，各組間方差齊性且符合正態性分布者，采用單因素方差分析或獨立t檢驗比較，非計數資料采用Pearsonχ2檢驗。

2結果

2.1兩組臨床生化指標的比較與對照組比較，冠心病組年齡、BMI、高血壓史、吸煙史、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、N-端腦鈉肽前體(NT-proBNP)和胱抑素C水平與對照組有顯著差別(P<0.05)。見表1。

2.2兩組外周血T淋巴細胞亞群組成比較與對照組比較，冠心病患者CD3+T以及CD4+T細胞數目顯著降低(P<0.05)，而CD8+T細胞和調節型T細胞(CD4+Foxp3+，Treg)則顯著降低(P<0.05)。見表2。

表1　各組患者臨床系生化指標比較±s)

表2　各組患者外周血T淋巴細胞數目的比較±s,個/μl)

2.3兩組外周血T淋巴細胞Stim1表達及其介導的Ca2+內流的比較與對照組比較，冠心病組T細胞內Stim1蛋白表達顯著增高(P<0.05)，且冠心病患者T細胞鈣離子內流顯著增加(P<0.05)。見圖1。

2.4兩組外周血炎癥因子表達的比較與對照組比較，冠心病患者外周血中IL-12、IFN-γ和IL-6水平均顯著增高(P<0.05)，而TGF-β水平則顯著降低(P<0.05)。與對照組比較，冠心病患者外周血中IL-4水平無顯著變化。見表3。

A：兩組患者淋巴細胞中Stim1蛋白表達情況，與對照組比較：1)P<0.05；B:兩組患者淋巴細胞Ca2+內流比較圖2　兩組患者T細胞Stim1表達及其Ca2+內流的比較

檢測指標對照組(n=61)冠心病組(n=64)P值IL-12430.±40.45903±207.60.000IL-4175.8±27.1141.7±3.70.259TGF-β94.3±5.176.3±7.60.047IFN-γ273.4±23.71614±2190.001IL-6632.8±88.41834±3670.019

3討論

近年來，免疫系統在動脈粥樣硬化發生、發展過程中的重要作用越來越被人所認識〔7〕。在動脈粥樣硬化斑塊內，內皮細胞和平滑肌細胞是血管的固有成分組成，研究表明在外界刺激因素作用下均可分泌多種炎癥因子，放大炎癥反應介導動脈粥樣硬化的發生〔8〕。斑塊內巨噬細胞的吞噬和分泌作用外，T 淋巴細胞在粥樣斑塊的進展中亦發揮著重要的作用〔8〕。

T細胞根據其表面抗原不同可分為CD4+T、CD8+T細胞等，其中CD4+T細胞具有協助體液免疫和細胞免疫功能，它通過分泌大量的細胞因子和促使B細胞產生抗體來發揮其免疫學功能。CD8+T細胞分為殺傷性T細胞和抑制性T細胞，具有抑制體液免疫和細胞免疫的功能〔9〕。近年來關于CD4+T淋巴細胞與動脈粥樣硬化發病關系的研究進展較快，CD4+T細胞又稱為Th細胞，即輔助型T細胞。Th細胞根據其激活時受到的外界刺激以及活化后的功能和分泌的細胞因子不同，可分為Th1、Th2和Treg亞群等。初始CD4+T淋巴細胞接受抗原刺激后首先分化為Th0細胞，Th0細胞繼續分化為Th1、Th2和Treg這3個細胞亞群。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-α、白介素-12和IFN-γ等細胞因子，Th1細胞激活推動動脈粥樣硬化的進展〔10〕；而Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等細胞因子，可延緩動脈粥樣硬化進展〔11〕；Treg細胞分泌大量的TGF-β。本研究，冠心病患者雖然Th細胞總數明顯升高，但TGF-β水平顯著降低，考慮Th細胞中Treg細胞總數降低，而被大量激活的Th細胞應該為Th1細胞，故我們在冠心病患者中檢測到Treg細胞減少，同時TGF-β分泌水平顯著降低。

鈣庫活化的鈣通道(SOC)能夠感受細胞內質網Ca2+庫耗竭，通過激活細胞膜上SOC成員如Stim1介導Ca2+內流。先前研究中發現通過抑制Stim1表達能夠顯著降低大鼠頸動脈新生內膜形成，延緩血管重構的發生〔12〕。本研究結果提示冠心病患者Stim1表達增高，從而促進T淋巴細胞Ca2+內流。新近Lee等〔13〕研究發現，在T細胞內抑制Stim1能夠顯著抑制T細胞表達IL-2、IFN-γ和IL-4等炎癥因子，而我們的研究則發現冠心病患者淋巴細胞中Stim1表達增高，并進一步使IL-6、IL-12和IFN-γ等炎癥因子表達顯著增高，而使TGF-β水平顯著降低。這些研究結果說明在冠心病患者Stim1介導的Ca2+內流調控T細胞內炎癥因子生成變化，進一步影響T細胞的功能并促進動脈粥樣硬化發生、進展。

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〔2015-06-24修回〕

(編輯徐杰)

Effect of stromal interaction molecule 1 mediated Ca2+influx on activation of peripheral blood T cell subsets in elder patients with coronary heart disease

HAO Pan,LONG Jun,WANG Duan,etal.

Department of Geratrics,the First Hospital Affiliated to the Third Military Hospital,Chongqing 400038,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of stromal interaction molecule 1 mediated Ca(2+) influx on activation of peripheral blood T cell subsets in elder patients with coronary heart disease(CHD).MethodsA total of 125 patients from January to December 2013 at the First affiliated hospital of the Third Military Medical University were selected.According to the results of coronary angiography,all the patients were divided into CHD and control groups.The clinical and biochemical indicators were collected for all patients.Differential centrifugation was used to collect peripheral blood lymphocytes,the number of T lymphocytes in all patients were determined by flow cytometric analysis.CD3+ T lymphocytes were collected by specifical immunomagnetic beads which binding to CD3 antigen on the cell surface.The expression of Stim1 protein was analyzed by Western-Blot assay.Calcium influx was measured by immunofluorescence assay.The inflammatory factor levels in plasma of all patients were determined with ELISA assay.ResultsCompared with the control group,age,body mass index(BMI),hypertension,smoking history,TC,LDL-C,HDL-C,NT-proBNP and cystatin C level in the CHD group were significantly different(P<0.05).The patients age,BMI,history of hypertension,smoking history,TC,LDL-C,NT-proBNP and cystatin C levels of CHD group were significantly higher than those of control group(P<0.05),whereas HDL-C levels was significantly lower(P<0.05).Compared with the control group,CD3+ T and CD4+ T cell number in CHD group were significantly higher(P<0.05),the CD8+ T cells and regulatory T cells(CD4+ Foxp3+,Treg)were significantly lower(P<0.05).In vitro,the expression of Stim1 and calcium influx were significantly increased in T cells of CHD patients than those of control patients(P<0.05).Moreover,the peripheral blood IL-12,IFN-γ and IL-6 level in CHD patients were significantly higher than those in control patients,while TGF-β levels were significantly lower.ConclusionsThe expression of Stim1 in T cells is higher in CHD patients.Stim1 may affect the activation of subset of blood T cells by influencing the Ca(2+) influx,which at least partly contributes to the progression of atherosclerosis.

【Key words】Stromal interaction molecule1;Ca(2+);Coronary heart disease;T cell

〔中圖分類號〕R541.4

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1313-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.015

通訊作者：司良毅(1957-)，男，教授，博士生導師，主要從事老年血管性疾病防治研究。

基金項目：國家自然科學基金資助(No.81370446)

第一作者：郜攀(1980-)，男，博士，講師，主要從事老年血管性疾病防治研究。