老年腦出血血腫周圍組織T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3表達及在腦出血發病中的意義

田少輝　許　磊　李盼祥　趙　瑜

(河北大學附屬醫院，河北　保定　071000)

?

老年腦出血血腫周圍組織T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3表達及在腦出血發病中的意義

田少輝許磊李盼祥趙瑜

(河北大學附屬醫院，河北保定071000)

〔摘要〕目的分析T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3在老年腦出血血腫周圍組織中的表達及其意義。方法因腦出血行血腫清除術老年患者40例根據手術距離發病時間分為≤6 h組、>6 h且≤24 h組、>24 h且≤72 h組和>72 h組，各10例。同時選取遠離血腫的正常腦組織10例作為對照組。采用免疫組化法檢測TIM-3蛋白表達，采用RT-PCR法檢測TIM-3 mRNA表達。結果各組TIM-3蛋白及mRNA表達水平均顯著高于對照組，且≤6 h組、>6 h且≤24 h組、>24 h且≤72 h組TIM-3及mRNA水平逐漸上升，>24 h且≤72 h組、>72 h組TIM-3及mRNA水平逐漸下降，>24 h且≤72 h組TIM-3及mRNA水平顯著高于其他各組(P<0.05)。結論TIM-3在腦出血發病后逐漸升高，至24～72 h升高至頂峰，之后逐漸下降，提示TIM-3可能和腦出血后炎癥反應有關。

〔關鍵詞〕T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子；腦出血

急性腦出血(ACH)發病率約占全部腦血管疾病的30%，其發病機制尚未明確，與高血脂、糖尿病、高血壓相關〔1〕。作為突發事件，ACH患者常會出現不同程度的應激反應，尤其是氧化應激反應與腦出血后的炎癥反應，血腫壓迫周圍腦組織，誘發組織缺血、缺氧，釋放大量炎性細胞因子，導致繼發性腦損傷。 T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3是TIMs家族一員，其蛋白產物為CD4+T細胞膜表面的一類受體分子，主要表達于活化CD+Th細胞膜上，與患者機體內T細胞活化、增殖及分化具有密切聯系〔2〕。本研究分析腦出血行血腫清除術老年患者腦出血血腫周圍組織TIM-3蛋白與mRNA表達。

1資料與方法

1.1一般資料我科2012年6月至2015年6月神經外科因腦出血行血腫清除術老年患者40例，年齡64～79歲，平均(68.71±3.75)歲。根據手術距離發病時間，分≤6 h組、>6 h且≤24 h組、>24 h且≤72 h組和>72 h組，各10例。均經頭顱CT或MRI診斷，符合1995年第4屆全國腦血管病學術會議的診斷標準〔3〕。同時選取遠離血腫的正常腦組織10例作為對照組。

1.2主要試劑和儀器兔抗人TIM-3多克隆抗體購自上海滬震實業有限公司，RT-PCR試劑盒和SP試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自上海信裕生物科技有限公司，PCR引物購自寶生物工程(大連)有限公司，Trizol購自福州晶康生物技術有限公司。山羊抗兔二抗HRP標記購自上海經科化學科技有限公司。YB-6型生物組織包埋機、YB-6B型烤片機購自湖北亞光醫用電子技術研究所，Leica TP1020型自動脫水機和RM2125切片機購自德國Leica公司，BX50 型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。RT-PCR分析儀購自北京晨曦勇創科技有限公司。

1.3檢測方法和觀察指標采用免疫組化染色檢測TIM-3蛋白表達。所有標本經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后，連續以5 μm厚度切片，進行免疫組化染色。石蠟切片脫蠟之后，滴加過氧化物酶阻斷液，常溫孵育10 min后，滴加一抗，37℃濕盒中孵育60 min，滴加二抗，常溫孵育10 min后，滴加過氧化物酶-鏈霉親和素溶液，常溫孵育10 min。每步之間用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，完成后，DAB顯色，細胞核以蘇木精復染，封片采用中性樹膠。陽性對照為已知陽性片，陰性對照為被PBS代替的一抗。高倍鏡(×400)視野下，隨機選取20個視野進行陽性細胞計數，取平均值為陽性細胞數。其中陽性細胞均為細胞質或細胞膜有淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。①細胞質無顯色，0分；②胞質呈淡黃色云霧狀，1分；③胞質呈棕黃色顆粒狀，2分；④胞質呈均勻深黃色，3分。記錄每張切片中腫瘤細胞顯色深淺(A、B、C、D)各占的百分數a、b、c、d，計算A×a+B×b+C×c+D×d，總分0分(-)、1分(+)、2分()、總分3分()。采用RT-PCR法檢測TIM-3 mRNA表達水平。內參基因β-actin的引物序列(299 bp)：上游5'-CCTGGACTTCGAGCAAGA-3'，下游5'-GGGCAGTGATCTCCTTCT-3'，目的基因TIM-3引物序列(558 bp):上游5'-CCAAATCCCAGGCATAAT-3'，下游5'-AAGCGACAACCCAAAGGT-3'。總RNA采用Trizol法提取，溶解后逆轉錄為cDNA，PCR擴擴增DNA片段共30個循環，凝膠成像系統對于經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產物進行數據分析。

1.4統計學方法采用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗。

2結果

各組TIM-3、mRNA表達水平均顯著高于對照組，且≤6 h組、>6 h且≤24 h組、>24 h且≤72 h組的TIM-3、mRNA水平逐漸上升，>24 h且≤72 h組、>72 h組TIM-3、mRNA水平逐漸下降，>24 h且≤72 h組TIM-3、mRNA水平顯著高于其他各組(P<0.05)，見表1。

表1　各組TIM-3、mRNA表達水平比較

與對照組相比：1)P<0.05；與≤6 h組相比：2)P<0.05；與>6 h且≤24 h組相比：3)P<0.05；與>24 h且≤72 h組相比：4)P<0.05；與>72 h組相比：5)P<0.05

3討論

急性腦出血對患者生活質量造成嚴重影響〔4〕。腦出血后腦血腫組織會釋放大量炎癥因子，CD4+T細胞按照分化與功能特征分為Th1細胞、Th2細胞、Treg細胞與Th17細胞，腦出血后血腫對周圍組織產生直接性壓迫，使血管床縮小，釋放的血管活性物質誘發血管痙攣，導致其發生系列變化，釋放凝血酶，浸潤炎性細胞，激活補體系統，釋放炎癥介質，促進細胞凋亡，腦出血后缺血體積超過血腫幾倍〔5〕。大量炎癥因子可以使腦微血管通透性及血腦屏障通透性增加，從而使大量炎癥細胞和炎癥因子透過崩潰的血腦屏障進入腦組織，吸收血腫清除壞死組織的同時也會加重腦出血后繼發性腦損傷〔6〕。

TIMs蛋白產物為CD4+T細胞膜表面的一類受體分子，TIM-3是其家族中首位參與T細胞免疫應答的成員，主要表達于Th1、Th17細胞等多種細胞表面，在適應性免疫與自然免疫中發揮重要作用〔7〕。相關文獻指出〔8〕，TIM-3與其配體半乳凝素-9相結合，負性調節Th1細胞，削弱Th1應答，促進Th1細胞凋亡。TIM-3可以通過激活Th1細胞，提高巨噬細胞數量與活性，促進Th1細胞所介導的細胞免疫應答反應能力，調節Th1細胞免疫應答并介導細胞免疫耐受〔9〕。腦組織出血<6 h時，經過細胞毒性受體傳遞凝血級聯反應與凝血酶，促使乳酸脫氫酶濃度增高，增加血管內皮細胞通透性，隨時間延長，TIM-3 mRNA表達增強，腦組織的壞死層、海綿層逐漸向周圍腦組織擴展，擴大腦水腫范圍〔10,11〕。腦組織出血>24 h，出血壞死的腦組織出現機械性壓迫、局部壓力增高、紅細胞溶解等因素導致神經元毒性損害，TIM-3 mRNA表達隨著出血時間逐漸增強，加重了腦組織不可逆壞死〔12〕。本研究提示TIM-3參與了腦出血早期病理過程，且通過多種調控機制，參與腦出血后多種細胞因子表達，參與腦出血炎癥反應。本研究說明，腦出血患者發病6 h后Th1與Th17細胞均被激活，分泌細胞因子，TIM-3及TIM-3 mRNA參與了腦出血后的病理過程，其水平隨著腦出血時間的延長而逐漸升高，加重患者腦出血后的組織損傷，這一結果與相關文獻的報道相一致〔13,14〕。

綜上，TIM-3在腦出血發生、發展中起到重要作用，其水平在腦出血發病后逐漸升高，至24～72 h升高至頂峰，之后逐漸下降，提示TIM-3可能和腦出血后的炎癥反應有關，可能成為腦出血基因治療新靶點。

4參考文獻

1林琇.腦出血后周圍組織繼發腦水腫病理機制研究進展〔J〕.中國醫藥科學,2015;9(2):33-5.

2畢勝,劉群,范佳,等.腦出血患者血腫周圍組織T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3的表達及意義〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(12):3201-2.

3中華神經科學會，中華神經外科學會．各類腦血管疾病診斷要點〔J〕．中華神經科雜志，1996;29(6)：379-80.

4何志義.microRNA與腦出血后腦水腫機制研究進展〔J〕.中國醫科大學學報,2014;43(11):961-4.

5Takeuchi S，Wada K，Toyooka T,etal.Temporal profile of plasma adiponectin level and delayed cerebral ischemia in patients with subarachnoid hemorrhage〔J〕.J Clin Neurosci,2014;21(6):1007-10.

6Lijin S,Jie Q,Bo S,etal.Increased frequency of circulating regulatory T cells in patients with acute cerebral hemorrhage〔J〕.Neurosci Lett,2015;5(591):115-20.

7胡瑞,張曉云,晏雪,等.腦出血后炎性反應機制的研究進展〔J〕.中國腦血管病雜志,2015;12(7):370-4.

8張永亮.人高血壓腦出血急性期外周血中IL-17的作用〔D〕.溫州:溫州醫科大學,2014.

9雷建衛.T細胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3)在肝細胞癌中的表達及意義〔D〕.河北:河北醫科大學,2013.

10彭傳梅,曹向紅,高輝.Tim基因家族及其與自身免疫性疾病的關聯研究進展〔J〕.實用醫技雜志,2015;5(2):157-9.

11陳婉婷,彭傳梅,高輝.Tim 基因家族與系統性紅斑狼瘡關系的研究進展〔J〕.國際檢驗醫學雜志,2015;17(11):1599-601.

12商小波,趙彩彥.T 淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3與肝臟疾病〔J〕.中華傳染病雜志,2014;8(11):696-8.

13王松存,李大金,杜美蓉.Tim-3信號免疫調節作用研究進展〔J〕.中國免疫學雜志,2014;15(11)：1563-6.

14張小梅,單寧寧,扈煜,等.原發免疫性血小板減少癥患者脾臟單個核細胞TIM-1及TIM-3的表達及其在Th1極化中的作用〔J〕.中華血液學雜志,2013;34(7):614-7.

〔2015-01-19修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R743.34

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1325-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.020

通訊作者：許磊(1976-)，男，主治醫師，主要從事腦血管病、腦腫瘤研究。

基金項目：河北科技發展項目(No.aj09x416)

第一作者：田少輝(1978-)，男，主治醫師，主要從事腦血管病、腦腫瘤研究。