PU.1在肺纖維化大鼠中的作用①

鮑文華，王　瑾，李樹民，楊曉東，馬雪梅，孫云暉

(佳木斯大學附屬第一醫院呼吸內科,黑龍江 佳木斯 154003)

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PU.1在肺纖維化大鼠中的作用①

鮑文華，王瑾，李樹民，楊曉東，馬雪梅，孫云暉

(佳木斯大學附屬第一醫院呼吸內科,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的:探討博來霉素所致肺纖維化大鼠中PU.1的表達水平，探究地塞米松對肺纖維化的作用機制。方法:將30只SPF級SD大鼠按照隨機數字表法分為健康對照組(N)，模型組(B)，地塞米松治療組(D)，每組10只。每組大鼠分別在第28天處死。氣管內注射博萊霉素制作肺纖維化模型。采用實時熒光PCR檢測肺泡灌洗液(BALF)PU.1mRNA的含量。結果:(1)模型組肺泡灌洗液PU.1mRNA含量明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。(2)地塞米松治療組PU.1mRNA含量較模型組明顯減低，差異有統計學意義(P<0.05)。結論:轉錄因子PU.1在肺纖維化中起作用，地塞米松可能通過下調PU.1的表達抗肺纖維化。

關鍵詞：肺纖維化；轉錄因子；PU.1；地塞米松

肺纖維化是間質性肺炎中最常見類型，預后較差。炎癥細胞、免疫細胞、肺泡上皮細胞、成纖維細胞及其分泌的介質和細胞因子，在引起肺間質纖維化的發病上起重要作用。富含嘌呤盒1(purine-rich box 1，PU.1)是E26(E-twenty six，ETS)轉錄因子家族成員，是造血干細胞增殖和分化的主要調節因子，維持機體細胞穩態，對機體炎癥及免疫起重要作用。本實驗，我們觀察肺間質纖維化大鼠PU.1的表達量，旨在探討轉錄因子PU.1在肺纖維化中的作用及地塞米松抑制肺纖維化的作用機制。

1材料與方法

1.1材料

博萊霉素購自美國Invitrogen公司，Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒由哈爾濱HaiGene公司提供。離心機為上海安亭公司產品、光學顯微鏡為奧林巴斯公司產品、PCR儀為Bio-Rad Min-Opticon2。

1.2方法

①模型建立：30只SPF級SD大鼠(佳木斯大學動物實驗中心提供)，6~8周齡，體重200~230g，按隨機數字表法分為三組：健康對照組(N)、模型組(B)、地塞米松治療組(D)，BLM組處理方案參照文獻[1]并在此方案上改進，采用氣管內注入博萊霉素制作肺纖維化模型，地塞米松治療組在肺纖維化模型基礎上第8天將3mg/kg地塞米松腹腔注入，健康對照組用生理鹽水替代博萊霉素，持續到第28天后處死。

②BALF的收集：以10%水合氯醛極量腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位于鼠板上，切開胸部，暴露氣管和主支氣管，結扎右主支氣管，用14號針頭插入氣管中，結扎，經氣管注入生理鹽水2mL，抽吸混勻，反復灌洗三次，共收集肺泡灌洗液4mL，1500r/min,離心15min，上清-80℃保存。

③肺組織標本的留取：暴露氣管與雙肺，分離肺組織，用止血鉗夾閉右肺門并結扎，立即取下右肺，PBS沖洗肺臟表面，用濾紙拭干，將肺組織給予4%多聚甲醛固定24h，常規石蠟包埋、切片，用于HE染色。

④PU.1mRNA測定：離心處理BALF，留取沉淀，采用Trizol法抽提RNA，逆轉錄為cDNA，實時熒光PCR檢測PU.1mRNA表達水平，引物序列為PU.1：5’- TGCTTCCCTTATCCACCCTTG-3’(上游)5’- TCTTCTTGCTGCCTGTCTCC-3’(下游)；GAPDH：5’-AACTCCCATTCTTCCACCTTT-3’(上游)5’-CTCTTGCTCTCAGTATCCTTG-3’(下游)。

1.3統計學方法

2結果

2.1肺組織形態學觀察

光學顯微鏡鏡下觀察N組肺組織結構正常，無纖維化改變。B組與N比較肺組織出現明顯纖維化改變，肺泡結構破壞，肺泡間隔明顯增寬，纖維沉積明顯，肺組織呈廣泛纖維化改變。D組與B組比較肺組織纖維化程度明顯減輕，肺泡間隔增厚減輕。依據Szapiel方法進行肺纖維化評分：0級:無纖維化；I級:病變范圍占全非20%以下；II級:病變范圍占全肺的20%～50%；III級:病變范圍超過全肺50%。與健康對照組比較，模型組和地塞米松治療組肺纖維化評分明顯增高；與肺纖維化組比較，地塞米松組肺纖維化評分降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1 。

表1　大鼠肺組織纖維化評分

注：與對照組比較，▲P<0.05;與肺纖維化組比較，#P<0.05。

2.2大鼠肺泡灌洗液PU.1mRNA含量比較

采用實時熒光PCR方法檢測大鼠肺泡灌洗液PU.1mRNA表達量，健康對按照組、模型組、地塞米松治療組PU.1mRNA含量分別為0.901±0.137、1.051±0.126、0.886±0.171，與健康對照組比較，模型組PU.1mRNA含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)地塞米松治療組較健康對照組無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，地塞米松治療組PU.1mRNA含量明顯減低，差異有統計學意義(P<0.05)。

3討論

肺纖維化(PF)系間質性肺炎中的一種，病變局限于肺部，引起彌漫性肺纖維化，導致肺功能損害和呼吸困難等癥狀。PF無明確流行病學資料，近年來臨床診斷的病例有增加趨勢，且死亡率高，5年生存率為70%，中位生存期為3年或出現癥狀后5年，目前肺纖維化目前尚無有效治療手段，預后差[2]。肺纖維化病因及機制尚不甚明了，損傷的肺泡上皮細胞、單核-巨噬細胞和淋巴細胞浸潤及其分泌的炎癥介質促進肺纖維化的發生發展，成纖維細胞增殖、細胞外基質質沉積，最終導致肺纖維化的形成。已有文獻表明，轉錄因子PU.1有助于造血干細胞向巨噬細胞方向和淋巴細胞方向正常增殖和分化，促進粒細胞炎癥趨化，同時調節炎癥相關細胞因子及受體[3]。所以，PU.1干預肺纖維化過程中多種細胞和因子的表達及作用。 目前肺纖維化亦無明顯有效治療手段，雖然推薦新藥吡非尼酮的應用，但因廣泛不良反應和價格昂貴，應用受限[4]。糖皮質激素作為抗肺纖維化藥物存在諸多爭議，根據最新指南，潑尼松、硫唑嘌呤、NAC三聯療法僅用于IPF患者[5]。

地塞米松作為糖皮質激素，通常認為其抗纖維化作用與抑制中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，抑制巨噬細胞增殖和分泌等有關[6,7]。

本研究結果表明，大鼠肺泡灌洗液中PU.1mRNA的表達含量模型組明顯高于健康對照組，表明PU.1可以促進肺纖維化的形成。與模型組組比較，地塞米松組PU.1mRNA含量明顯減低，差異有統計學意義，且大鼠肺纖維化經過地塞米松治療后PU.1含量接近健康對照組，兩者無明顯差異，說明地塞米松起到一定抗纖維化作用。轉錄因子PU.1及地塞米松在肺纖維化中的作用均與炎癥細胞及免疫細胞有關，故而猜想地塞米松可能通過抑制PU.1起到抗肺纖維化的作用。肺纖維化的發病機制和治療均尚不明確，本研究結果初步顯示轉錄因子PU.1在大鼠肺纖維化中起作用，地塞米松可能通過抑制PU.1的表達含量起到抗纖維化的作用。具體將在后續研究中進一步探討。

參考文獻:

[1]Syrbu S, Thrall RS, Smilowitz HM. Sequential appearance of inflammatory mediators in rat bronchoalveolar lavage fluid after oleic acid-induced lung injury[J].Exp Lung Res,1996,22(1):33-49

[2]Subodh V，Arthur S． Idiopathic pulmonary fibrosis— new insights[J]．New Engl J Med，2007，13:1370-1372

[3]王權，孫文逵，施毅.轉錄因子PU．1與機體免疫功能的相關性及其研究進展[J].J Med Postgra，2013, 26(10)：1096-1100

[4]胡艷秋，于連，胡俊華，等.肺靶向吡非尼酮脂質體的制備及體外釋藥性質研究[J].黑龍江醫藥科學,2012,35(3)：69

[5]An afficial ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guide-line：Treatment of Idiopathic pulmonary fibrosis[J]. American Journal of Respiratory and Clinical Care Medicine，2015，2(192):3-19

[6]Li H P，Li X，He G J，et al． The influence of dexamethasone on the proliferation and apoptosis of pulmonary inflammatory cells in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J]．Respirology，2004，9(1):25-32

[7]Chen F，Gong L，Zhang L，et al． Short courses of low dose dexamethasone delay bleomycin-induced lung fibrosis in rats[J]．Eur J Pharmacol，2006，536(3):287-295

(收稿日期:2015-11-20)

中圖分類號：R563

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0015-02

作者簡介：鮑文華(1962～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。

基金項目：1.黑龍江省自然科學基金項目，編號：H201370；2.佳木斯大學研究生科技創新項目，編號：LM2015_033。