神經干細胞的研究進展

楊 瑞 吳曉君 賈 微 岑妍慧（廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001）

神經干細胞的研究進展

楊 瑞 吳曉君 賈 微 岑妍慧
（廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001）

神經干細胞是指能自我更新并具有分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，并足以提供大量神經組織細胞的一類細胞。自從90年代以來，人們相繼從各種動物和人的中樞系統分離和培養出神經干細胞（neural stem cell,NSC）[1,2]。近年來，神經干細胞的發現和研究日益深入，為神經系統損傷和退行性變的治療帶來希望[3]。文章對神經干細胞來源、分離培養及鑒定方法和筆者的一些實際工作體會做一綜述。

神經干細胞；分離；培養

1 神經干細胞的來源及其特征

分離培養神經干細胞技術的發展已經有幾十年的歷史，目前已有新生大鼠和新生小鼠作為神經干細胞來源的原代培養神經干細胞，胚胎發育過程中，神經干細胞分布于神經管的管壁[4]，有研究在海馬和紋狀體也終生存在神經干細胞[5]。近來有研究表明，皮層中亦有NSCs分布。[6]神經干細胞(Neural stem cells,NSCs)屬于多能干細胞，是具有分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的潛能和自我更新并足以提供大量神經組織細胞的潛能的細胞[7,8]。他們受某些特定因素的調節：如神經生長因子、神經功能活動、應激反應等，特別是許多神經生長因子的調節作用對干細胞的增殖和擴增尤為重要，包括成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子以及胰島素樣生長因子-I等均可有效地促進神經干細胞的分裂和增殖，另外白血病抑制因子及其受體（leukemia inhibitory factor receptor，LIFR）介導的信號傳遞通路在神經干細胞的增殖過程中也起了重要的作用[9]。

2 神經干細胞分離、培養方法的比較

制備體外原代神經干細胞常用方法有：單純機械吹打法、胰蛋白酶消化法。

2.1 非酶分離細胞法

2.1.1 單純機械吹打法

大鼠乙醚麻醉后，首先用消毒酒精消毒其皮膚，然后迅速取出腦組織并分離兩側海馬。D-Hanks液漂洗，反復切割組織，放入離心管中，吸管反復吹打至無可見組織切塊，再用200目細胞篩網過濾，然后制成單細胞懸液。經細胞計數后，分裝入50ml培養皿中，細胞數約為5*105/ml[10]。該方法操作簡單，無需復雜以及和胰蛋白酶，經機械分離得到的單細胞活性要比酶分離得到的單細胞活性大。

2.1.2 無血清培養基培養法

最常用的是原代細胞體外培養法，神經干細胞具有持續增殖的能力，血清中含有許多誘導NSCs 分化的物質，所以目前采用無血清培養[11]。一般用堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子刺激細胞生長，有研究表明，生長因子的密度會影響到神經干細胞的生長，密度過高對其生長起到抑制作用，密度過低不利于神經干細胞增殖，嚴重則導致懸浮的細胞貼壁分化最后衰老死亡[12]。

2.2 酶分離細胞法

2.2.1 胰蛋白酶消化法

出生24 h 內的新生SD 大鼠，用消毒頭部后，斷頭處死，無菌條件下D-Hank’s液中打開顱腔，分離出海馬，去除腦膜和血管，稍靜置待組織沉入離心管底部，棄去上清，加入0.25 %胰蛋白酶1mL，37℃消化10 min 后加入4mL添加10%血清的DMEM/F12培養基終止消化，用尖端拋光的玻璃管輕輕吹打至無可見的組織塊，離心、重懸即可獲得神經干細胞[13]。此法用胰蛋白酶分化，操作簡單，分離效果較好，價格便宜。但在實際操作中很難客觀準確地把握酶作用的最佳時間，嚴重影響細胞活性，酶消化細胞間質的同時也消化了細胞本身。實驗采用機械分離和消化分離相結合的方法，分離培養了大鼠腦神經干細胞，結果證實采取這一方案種植的細胞生長良好[11]。

2.2.2 傳代懸浮培養

在原代培養的第3天能夠清楚地觀察到神經干細胞以漂浮的細胞團的方式生長，即形成神經球[14]。神經球在培養基中呈懸浮生長，予以更換半量培基，在培養條件不變的情況下，1周后用吸管輕柔吹打球形克隆成為小的神經球和單細胞懸液，細胞球大小基本一致，細胞的折光性增強。劉立[15]的研究結果發現接種初期有突起和生長錐的細胞在無血清培養環境下逐漸死亡，貼壁的多會生長出短突起，細胞球迅速貼壁并分化為神經元和膠質細胞，但隨培養時間的延長，細胞全部呈懸浮狀。

與懸浮法對比，貼壁培養法更利于進行細胞形態學的觀察，獲取大量同質化的細胞，對體內移植、基因操作、進行嚴格的克隆分析和發育學研究具有重要意義。

3 本實驗培養離體神經干細胞的經驗

通過以上方法反復大量的實驗對比，筆者采用了飼養層條件下培養神經干細胞的穩定抑制神經干細胞的分化、促進神經干細胞的分裂增殖及保持神經干細胞的多向分化潛能的條件。現將方法敘述如下：取15～16d左右的雄性小鼠的睪丸，經0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液,培養48h后換液去除懸浮的生精細胞和間質細胞達到純化睪丸支持細胞的目的,然后把部分生長良好的Sertoli細胞消化下來，經洗滌、固定、脫水、包埋和聚合等步驟后使用LKB-V型超薄切片機切片，鈾、鉛各復染10min，在日立H-500型透射電子顯微鏡下觀察，拍照。其余生長狀態良好的Sertoli細胞繼續培養待其貼滿瓶底表面積80%左右用0.25%胰蛋白酶消化傳代，連續傳至第三代待細胞長滿瓶底表面積90%以上時，使用絲裂霉素C溶液處理以抑制其分裂增殖以作為飼養層。

組織化學染色進行堿性磷酸酶檢測：神經干細胞堿性磷酸酶呈陽性，表明其分化程度低；目前檢測巢蛋白的表達是鑒定神經干細胞最重要最常用的指標[16]。免疫組織化學染色檢測神經干細胞表面特異性分子標志物-巢素蛋（Nestin）：神經干細胞Nestin染色呈陽性，胞質被染成棕黃色，表明分離出的為神經干細胞[17]，分化后的細胞表達神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的特異性抗原[18]。

4 結語

目前，神經干細胞的體外培養與分離技術迅速發展，隨著研究的深入，移植治療發生退行性變的神經細胞修復機制[19]的探討奠定了基礎，以及NSCs 移植將有可能成為治療神經變性疾病和腦損傷的有效手段[20]。目前最理想的策略是從需要治療的患者體內取出NSCs用于自身治療[21]。

[1] Galli R,Gritti A,Bonfanti L,et.Neural stem cells:an overview[J]. Circ Res,2003,92:598-608.

[2] Villa A,Snyder E Y,Vescovi A,et al. Establishment and properties of a growth factor-dependent, perpetual neural stem cell line from the human CNS.Exp Nuerol, 2000,161:67-84.

[3] 魏東光,吳承運,辛華,等.神經干細胞的體外擴增及移植應用[J].中華器官移植雜志,2001,22(2):122-123.

[4] Hsu YC, Lee DC, Chiu IM. Neural st em cells, neural progenitors,and neurot rophic f actors[J].Cell Transplant, 2007,16(2):133-1501.

[5] Mckay R.Stem cells in the central nervous system[J]. Science,1997,276(5309):66-71.

[6] 彭鋼,湯奇勝,朱劍虹,等.活體取材山羊皮層組織神經干細胞的培養與鑒定[J].中華神經外科疾病研究雜志,2011, 9(6):525-528.

[7] Whit e PM, Morrison SJ,Orimoto K, et al. Neural crest stem cellsundergo cel-l intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive different iation signals[J].Neuron, 2001,29(1):57-711.

[8] Okada S, Okano H.Regulat ory mechanisms of neural st em cell and strategies for therapy[J].Nippon Rinsho,2003,61 (3):449,56.

[9] Koo pman P, Cot to n RA . Factor produced by feeder cells w hich inhibits embry onal carc-inoma cell dif ferentiat ion character izat ion and part ial purificat ion[J].Exp Cell Res,1984,154(1):233-242.

[10] 譚新杰,胡長林,蔡文琴,等.新生大鼠海馬神經干細胞的分離、培養、分化和鑒定[J].國際腦血管雜志,2006,14(2):107-109.

[11] 李明新,闞世廉,張建國.無血清條件下體外分離培養鼠胚胎腦組織神經干細胞[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(14):2696-2700.

[12] Wachs FP,Couillard-Despres S,Engelhardt M,et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells[J]. Lab Invest,2003,83(7):949,62.

[13] 陳凱,康現江,張平,等.大鼠海馬神經干細胞的分離培養與免疫熒光鑒定[J].醫學研究與教育,2010,27(2):1-16.

[14] 張蕾,李曉莉.神經干細胞的分離培養和鑒定及體外長期培養[J].中國現代醫學雜志,2012,22(20):52-55.

[15] 劉立,彭超華,梁鵬,等.小鼠胚胎中腦區神經干細胞體外分離培養的特征[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11 (24):4666-4669.

[16] A NYH,WANH,ZHAN GZS,et al.Effect of rat Schwann cell secretion on proliferation and differentiation of hum an neural stem cells[J].Biom ed Environ Sci,2003,15:55260.

[17] 任紅苗,王宜南,陳繼川,等.胚胎小鼠聽皮層區域神經干細胞的分離培養及鑒定[J].中華耳科學雜志,2011,9(4):433-437.

[18] 劉仕勇,張可成,楊輝,等.神經干細胞的分離培養及其鑒定[J].第三軍醫大學學報,2002,22(1):26-28.

[19] Zhao Y,ST Yao,and SJ Wang,Neural stem cell transplantation in the hippocampus of rats with cerebral ischemia/reperfusion injury Activation of the phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway and increased brain-derived neurotrophic factor expression. Neural Regeneration Research,2010,5(21): 1605-1610.

[20] RENFRANZ PJ,CUNNINGHAM MG,MCKAY RD.Region 2 specific differentiation of the hippocampal stem cell line HiB5 upon implantation into the developing mammalian brain[J].Cell,1991,66:713-729.

[21] DOETSCH F, CAILLE I,LIM DA,et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian[J]. Cell,1999,97:703-716.

The research progress of neural stem cells

The neural stem cells are to point to self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes, and enough to provide a lot of nerve tissue cells. Since the nineties, people have been isolated from various animals and human central nervous system and cultivate neural stem cells[1,2].In recent years, the discovery of neural stem cells and in-depth research, for the treatment of nervous system damage and degeneration[3].Cultivation in this paper, the sources of neural stem cells and identifying methods and some actual work experience of the author.

neural stem cells; segregation; incubation

R745

A

1008-1151(2016)11-0052-02

2016-10-11

國家自然科學基金項目（81503406）；廣西高校科研課題（ZD2014068）；廣西壯族自治區衛生廳中醫藥科技專項課題（GZPT13-04、GZBZ16-07、GZLC16-23）。

楊瑞（1981－），男，湖北潛江人，廣西中醫藥大學講師，碩士。