去乙酰化酶抑制劑VPA對巨噬細胞極化過程的影響①

張　穎　白　力　張文蘭　尹學紅　張　偉　龐春艷　王永福

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院，包頭014040)

?

·基礎免疫學·

去乙?；敢种苿￢PA對巨噬細胞極化過程的影響①

張穎白力張文蘭尹學紅張偉龐春艷王永福

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院，包頭014040)

[摘要]目的：本研究通過分析去乙?；敢种苿奘杉毎麡O化過程中組蛋白修飾的影響，以及對巨噬細胞極化過程的影響，分析去乙酰化酶抑制劑是否可以通過改變巨噬細胞的組蛋白修飾,進而影響巨噬細胞極化的過程，旨在為治療自身免疫性疾病提供新的思路。方法：利用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)誘導J774.1巨噬細胞24 h，白細胞介素4(Interleukin-4，IL-4)誘導J774.1巨噬細胞24 h，并在誘導過程中加入2 mmol/L丙戊酸(Valproic acid，VPA)，收集巨噬細胞，實時免疫熒光定量PCR和ELISA法檢測巨噬細胞極化的特異性標記基因的表達，流式細胞術和細胞免疫熒光法檢測組蛋白修飾情況。結果：J774.1細胞經LPS和IFN-γ誘導24 h極化為M1型巨噬細胞；經IL-4刺激24 h極化為M2型巨噬細胞，VPA處理后的M1型巨噬細胞組蛋白H3K9的乙?；潭壬撸瑯擞浕虬准毎樗?(Interleukin-6,IL-6)、誘導性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、CC趨化因子配體2[Chemokine(C-C motif) ligand 2，CCL2]的表達量降低，CD86的表達量升高；VPA處理后的M2型巨噬細胞組蛋白H3K9的乙酰化程度也升高，標記基因精氨酸酶(Arginase-1,Arg-1)、Fizz-1(Found in inflammatory zone-1,Fizz-1)、甘露糖受體(CD206)、Ym1的表達量升高。結論：巨噬細胞的極化狀態和組蛋白的修飾具有一定的相關性，VPA在M1型巨噬細胞誘導體系中可以促使M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化，但是在M2型巨噬細胞誘導體系中，卻抑制了M1型巨噬細胞的特異性基因的表達。

[關鍵詞]組蛋白修飾；巨噬細胞極化；去乙?；敢种苿籑1型巨噬細胞；M2型巨噬細胞

巨噬細胞幾乎存在于機體的各個器官與組織，在免疫應答、宿主防御、維持內環境穩定中發揮極其重要的作用，并且作為主要的抗原遞呈細胞在啟動適應性免疫應答過程中起著至關重要的作用。巨噬細胞具有高度異質性，分布組織、器官的不同或局部微環境的改變，甚至體外刺激的差異，都會導致巨噬細胞表現出不同的免疫應答，從而獲得不同的功能表型[1,2]。根據巨噬細胞活化后的不同表型，巨噬細胞被分為M1 型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞又稱經典活化巨噬細胞(Classically activated macrophages，CA-Mφ)，M2型巨噬細胞又稱替代活化巨噬細胞(Alternatively activated macrophages，AA-Mφ)[3]。目前常采用IFN-γ或是LPS、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和粒細胞巨噬細胞刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)刺激誘導M1型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有IL-12hi、IL-23hi、IL-10low的表型，同時分泌一系列的可以誘導Th1細胞免疫反應的效應分子，例如活性氧化物(Reactive oxygen ，ROX)以及炎性細胞因子IL-1、TNF-α和IL-6[4-8]。與M1型巨噬細胞相對應的是由IL-4和IL-13誘導產生的M2型替代活化巨噬細胞[9-11]。M2型巨噬細胞具有IL-12low、 IL-23low的表型，并且高表達清道夫受體和甘露糖類型的受體[12]。M2型巨噬細胞誘導Th2型免疫應答，產生抗炎性細胞因子，具有促進組織修復和重建的能力，并且具有改善Th1型免疫應答反應誘導的自身免疫性疾病的能力[1]。已公認的M1型特異性表達的基因為TNF-α、IL-6、iNOS、CCL-2、CD86，M2型特異性表達基因為CD206、Arginase、Fizz-1、Ym1[13]。

目前已有的研究表明，去乙?；敢种苿┯锌寡椎奶匦訹1]。VPA是Ⅰ類去乙酰化酶抑制劑，它在組蛋白修飾、轉錄、核小體重塑中起著作用[14]。VPA首先被應用于癌癥治療的領域，研究證明可以通過抑制組蛋白去乙?；?Histone deacetylase,HDAC)的作用，使核小體組蛋白乙酰化，改變HDAC參與的基因表達。

本研究在小鼠巨噬細胞極化過程中加入去乙?；敢种苿￢PA，分析VPA是否通過改變巨噬細胞的組蛋白修飾，進而使巨噬細胞極化方向發生改變，最終改變巨噬細胞的細胞因子的分泌。

1材料與方法

1.1材料CD86/B7-2 抗體、Mannose Receptor/CD206 Antibody、Rat IgG 2a Isotype Control、Goat Anti-rat IgG/PE(ebioscience，USA)；Rabbit IgG Isotype Control Alexa Fluor? 488 Conjugate(Cell signal,USA)；反轉錄試劑盒RR037A、Trizol、熒光定量試劑盒DR041A(TaKaRa,China);Recombinant Mouse IL-4/Interleukin-4、Recombinant Mouse Interferon-γ(Sino Biological,USA)；LPS(Sigma，USA)；TNF-α、IL-6、CD206細胞因子檢測試劑盒(新啟迪,China)；Acetyl-Histone H3K9抗體(Invitrogen,USA)；VPA、StemoleculeTMValproic Acid(STEMGENT,USA)。

儀器：熒光定量PCR儀(BIOER,LineGene 9640，China),流式細胞儀(BD FACSCantoTMⅡ，USA)，酶標儀(Rayto，RT-6500，China)。

1.2方法

1.2.1M1型和M2型巨噬細胞的誘導方法取J774.1巨噬細胞用DMEM/F12+10%FBS培養體系培養細胞至90%匯合度后用胰酶消化細胞3 min，1 600 r/min離心，細胞計數。用DMEM/F12+10%FBS培養體系將J774.1巨噬細胞稀釋成1×105ml-1細胞濃度并接種于6.0 cm培養皿中(作為對照組C組)；用100 ng/ml LPS+30 ng/ml IFN-γ M1型誘導培養體系將J774.1巨噬細胞稀釋成1×105ml-1細胞濃度并接種于6.0 cm培養皿中(作為M1型巨噬細胞組)；用100 ng/ml IL-4 M2型誘導培養體系將J774.1巨噬細胞稀釋成1×105ml-1細胞濃度并接種于6.0 cm培養皿中(作為M2型巨噬細胞組)，放置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養24 h。

1.2.2MTT法檢測VPA處理巨噬細胞的最適濃度①接種細胞：以每孔1 000～10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。②培養細胞：培養細胞24 h。③呈色：培養24 h后，每孔加MTT溶液(5 mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20 μl，繼續孵育4 h，終止培養，然后每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。④比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。計算IC50，計算方法：lgIC50=Xm-I[(P-(3-Pm-Pn)/4]，其中Xm:lg 最大劑量，I:lg(最大劑量/相臨劑量)，P:陽性反應率之和，Pm:最大陽性反應率，Pn:最小陽性反應率。

1.2.3去乙酰化酶抑制劑(VPA)處理極化巨噬細胞C組、M1組、M2組按前面所述方法培養，用M1型誘導培養體系加2 mmol/L濃度VPA，將J774.1巨噬細胞稀釋成1×105ml-1細胞濃度并接種于6.0 cm培養皿中(作為M1+VPA組)；用M2型誘導培養體系加2 mmol/L濃度VPA，將J774.1巨噬細胞稀釋成1×105ml-1細胞濃度并接種于6.0 cm培養皿中(作為M2+VPA組)，放置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養24 h。培養完成后，收集細胞上清液和細胞。

1.2.4流式鑒定J774.1巨噬細胞細胞表面標記物收集VPA處理極化的巨噬細胞，各組分別經過4%多氯甲醛、體積分數為90%甲醇(提前4℃預冷)處理后，分別加入300 μl一抗(CD86、CD206)，輕輕混勻，室溫避光孵育1 h；5 min，1 600 r/min離心，收集細胞，再分別加入300 μl二抗，室溫避光孵育30 min；上流式細胞儀檢測。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測巨噬細胞特異性基因的表達利用RNAiso Plus方法提取細胞內總RNA，之后反轉錄成cDNA，4 ℃保存，備用。引物由上海生工合成，具體引物序列見表1。

將配置好的PCR反應液放入PCR儀中，設置程序和條件為：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40循環；95℃反應15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s 進行擴增，qRT-PCR 由熒光定量 PCR儀自動采集目的基因與內參基因的Ct值。各個基因的基因表達量根據公式計算。實驗組/對照組目的基因相對表達量△Ct=Ct(實驗組/對照組目的基因)-CT(β-actin)；△△CT=實驗組△CT-對照組△CT；目的基因實驗組和對照組間的相對表達量(即實驗組目的基因相對表達量相對于對照組的倍數)=2-△△CT。

表1實時定量PCR引物序列

Tab.1Primer sequences for real-time PCR analysis

PrimernamePrimersequenceIL-6Forward:5'-TGATGGATGCTACCAAACTGG-3'Reverse:5'-TGGTCTTGGTCCTTAGCCACT-3'TNF-αForward:5'-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3'Reverse:5'-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3'CCL2Forward:5'-AAGAGGATCACCAGCAGCAG-3'Reverse:5'-GGTCAGCACAGACCTCTCTCTT-3'CD86Forward:5'-ACGGACTTGAACAACCAGAC-3'Reverse:5'-TGCAGTCCCATTGAAATAAG-3'Arg-1Forward:5'-CAGAAGAATGGAAGAGTCAG-3'Reverse:5'-CAGATATGCAGGGAGTCACC-3'CD206Forward:5'-GGAAACGGGAGAACCATCAC-3'Reverse:5'-GGCGAGCATCAAGAGTAAAG-3'Fizz-1Forward:5'-TGATGGTCCCAGTGAATAC-3'Reverse:5'-GGCCCATCTGTTCATAGTC-3'Ym1Forward:5'-AGCAATCCTGAAGACACC-3'Reverse:5'-CCCTTCTATTGGCCTGTC-3'β-actinForward:5'-ACCGTGAAAAGATGACCCAG-3'Reverse:5'-AGCCTGGATGGCTACGTACA-3'

1.2.6流式細胞術檢測細胞乙酰化變化收集各組已用極化因子和VPA處理24 h后的巨噬細胞，每組細胞分別用多聚甲醛、 90%的甲醇處理，用1 ml PBS+5/1 000牛血清白蛋白(BSA)洗滌；對照組中加入200 μl PBS+5/1 000 BSA，同型對照組中加入200 μl PBS+5/1 000 BSA+Rabbit IgG Isotype Control(AlexalR)488,其余各組中加入200 μl一抗H3K9 Ace，孵育后收集細胞，同型對照組中加入150 μl PBS+5/1 000 BSA，其余各組中加入150 μl二抗[1 ml PBS+PBS+5/1 000 BSA +Anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor(R)488]，孵育30 min；將各組細胞分別加入到各檢測管中，上機。

1.2.7免疫熒光方法檢測細胞乙酰化變化取VPA處理的極化巨噬細胞，用PBS洗一次，再用100%甲醇浸沒細胞，在甲醇中-20℃孵育10 min，然后用PBS沖洗5 min；將樣品在封閉液中封閉60 min；加入稀釋的一抗，4℃孵育過夜；用PBS沖洗3次，將樣品與用抗體稀釋液稀釋的熒光標記二抗在室溫下避光孵育1～2 h；蓋上玻片；立即在顯微鏡下用相應波長激發光觀察樣品。

1.2.8ELISA法測定巨噬細胞上清中細胞因子TNF-α、IL-6、CD206的表達情況收集VPA處理極化的巨噬細胞上清液，分別將標本或不同濃度標準品加入相應孔中(100 μl/孔),封反應孔，加入生物素小鼠抗體工作液(100 μl/孔)，之后除空白孔外，加入酶結合物工作液(100 μl/孔)，再加入TMB顯色工作液(100 μl/孔)，最后加入終止液(100 μl/孔)，混勻后即刻測量OD(450nm)值(10 min內)。

2結果

2.1MTT法測定VPA對巨噬細胞活性的影響用IC50計算公式計算IC50得出為2.961，IC50值的1/3～1/2為VPA的最適濃度，可以得出2 mmol/L濃度的VPA為合適的處理濃度(見表2)。

2.2不同刺激條件下J774.1細胞的形態從圖1中可以看出，巨噬細胞極化成M1型巨噬細胞時，細胞梭形，多觸角形態，極化成M2型巨噬細胞時，細胞圓潤，呈聚團現象，VPA處理的M1型巨噬細胞體積明顯變大，變長，呈條索樣形態，VPA處理的M2型巨噬細胞聚團現象消失，細胞體積變大，部分細胞出現觸角，呈星形，單純VPA處理的巨噬細胞體積變大，成多觸角毛刺樣形態。

2.3流式鑒定J774.1巨噬細胞細胞表面標記物CD86/CD206CD86流式鑒定結果顯示：C、IS、M2、M2+VPA組CD86為陰性，而M1和M1+VPA組CD86為陽性，且M1+VPA組陽性率高于M1組(見圖2)。

CD206流式鑒定結果顯示：C、IS、M1組CD206為陰性，而M1+VPA、M2、M2+VPA組CD206為陽性(見圖3)。

VPA(mmol/L)ODvalues00.2672±0.019410.2737±0.027120.2517±0.025230.2399±0.02673)40.2320±0.02692)50.2486±0.02513)60.2264±0.02471)70.2232±0.02283)80.2118±0.02323)IC502.961

Note：Compared with the control group，1)P<0.05，2)P<0.010，3)P<0.005.

圖1　不同刺激條件下J774.1細胞的形態Fig.1　Morphology of J774.1 cells under different stimulation conditionsNote: A.J774.1 cells;B.M1 macrophages;C.M1 macrophages with VPA treated;D.M2 macrophages;E.M2 macrophages with VPA treated;F.J774.1 cells with VPA treated.

2.4不同刺激條件下J774.1細胞相關因子的mRNA表達量LPS(100 ng/ml)+IFN-γ(30 ng/ml)+VPA(2 mmol/L)刺激增殖狀態的J774.1細胞24 h，或者IL-4(100 ng/ml)+VPA(2 mmol/L)刺激增殖狀態的J774.1細胞24 h，分別檢測相關因子的mRNA表達量。結果顯示：VPA處理后的M1型巨噬細胞中，IL-6(P=0.000 2)、iNOS(P=0.001 3)、CCL-2(P=0.000 7)的表達量明顯減少,CD86(P=0.016 8)、Arg-1(P<0.005)、CD206(P<0.005)、Ym1(P=0.000 3)的表達明顯升高;VPA處理后的M2型巨噬細胞中，IL-6(P=0.000 6)、iNOS(P=0.023 5)、CCL-2(P=0.008 6)的表達量明顯減少，Arg-1(P<0.005)、Fizz-1(P<0.005)、CD206(P=0.000 4)、Ym1(P=0.042 8)的表達量明顯增加(見圖4)。

圖2　CD86流式鑒定結果Fig.2　Flow identification results of CD86Note: A.Control group;B.Same type control group;C.M1 macrophages group;D.M1 macrophages +VPA group;E.M2 macrophages group;F.M2 macrophages +VPA group.

圖3　CD206流式鑒定結果Fig.3　Flow identification results of CD206Note: A.Control group;B.Same type control group;C.M1 macrophages group;D.M1 macrophages +VPA group;E.M2 macrophages group;F.M2 macrophages +VPA group.

2.5不同刺激條件下J774.1細胞上清液細胞因子水平測定VPA處理后的M1型巨噬細胞中，IL-6(P=0.000 2)、TNF-α(P=0.012 0)的表達量明顯減少，CD206(P=0.036 1)的表達量明顯增加；VPA處理后的M1型巨噬細胞中,IL-6(P=0.010 1)、TNF-α(P=0.014 4)的表達量明顯減少，CD206(P<0.005)的表達量明顯增加(如圖5)。

圖4　RT-PCR 法結果顯示VPA處理J774.1巨噬細胞后IL-6、iNOS、CCL-2、CD86、Arg-1、CD206、Fizz-1、Ym1 mRNA相對表達量變化Fig.4　RT-PCR shows relative expression of IL-6,iNOS,CCL-2,CD86,Arg-1,CD206,Fizz-1,Ym1 mRNAs in Polarized J774.1 cells treated with VPA for 24 hNote: The levels of cytokines are expressed relative to the levels of β-actin(0.01).

2.6VPA處理極化的巨噬細胞表觀遺傳學方面的改變免疫熒光方法和流式細胞術方法檢測VPA處理極化巨噬細胞后組蛋白H3K9乙酰化的變化，結果顯示VPA使巨噬細胞組蛋白H3K9乙?；矫黠@增加(P=0.048 4)(見圖6)。A為免疫熒光方法檢測VPA對M1型細胞組蛋白H3K9乙?；挠绊懀珺為流式細胞術檢測細胞VPA對M1型細胞組蛋白H3K9乙?；挠绊?，C為免疫熒光方法檢測VPA對M2型細胞組蛋白H3K9乙?；挠绊?，D為流式細胞術檢測細胞VPA對M2型細胞組蛋白H3K9乙?；挠绊憽?/p>

圖5　ELISA檢測VPA處理后巨噬細胞上清液中IL-6、TNF-α、CD206表達量變化Fig.5　ELISA assay detects expression of IL-6,TNF-α and CD206 in supernatant of macrophages treated by VPA

圖6　VPA對巨噬細胞表觀遺傳學影響Fig.6　Effect of VPA on epigenetics of macrophage

3討論

眾所周知，巨噬細胞的極化現象在自身免疫性性疾病的發生發展過程中廣泛存在，其極化調節主要是通過一些核內的信號蛋白發揮作用[15]。巨噬細胞極化的平衡失調能反映局部組織的微環境炎癥狀態，具有促炎特性的 M1 型巨噬細胞和具有抗炎特性的M2型巨噬細胞間的相互轉化，可以使巨噬細胞在不同微環境獲得不同的功能表型，這一特點使它在機體不同生理、病理條件下發揮不同的功能，在疾病的發生、發展中發揮重要作用[5]。

在炎癥的發生和發展過程中，由于受到不同的細胞信號通路和細胞因子的調控和影響，M1/M2亞型的平衡一直處于動態變化中，向任何一方的傾斜都決定了炎癥的最終轉歸，而M2型巨噬細胞的抗炎作用在多種自身免疫性疾病中都有治療作用。

去乙?；敢种苿￢PA在調控獲得性免疫反應中起著多方面的作用，它可以通過調節信號通路使得抗原表達量增加，輔助T細胞(Th)極化，淋巴細胞成熟,并且可以調控共刺激分子表達和細胞因子的產生[16]，這可以解釋巨噬細胞在自身免疫性疾病中表現出來的巨大的可塑性。即VPA能夠緩解由Th1型免疫應答反應引起的自身免疫性疾病的癥狀[1]。雖然去乙?；敢种苿￢PA在治療自身免疫性疾病等方面的作用已經得到了廣泛的認同，但是在巨噬細胞極化過程中組蛋白修飾的機制還存在著很多未知的地方。

有研究表明VPA能夠通過組蛋白修飾抑制核轉錄因子(Nuclear transcription factor ，NF-κB)通道的活性，減少炎性因子的產生[3]。本實驗中發現去乙?；敢种苿￢PA和極化過程中的J774.1細胞共培養后，可以抑制炎性因子IL-6、iNOS、CCL-2的表達，促進CD86的表達；促進抑炎性因子Arginase、Fizz-1、CD206、Ym1的表達，說明去乙酰化酶抑制劑VPA能夠使巨噬細胞的表型發生改變，從M1型向M2型轉化。而本實驗中也觀測到了VPA使M1型巨噬細胞的組蛋白H3K9的乙酰化程度升高。研究表明去乙?；敢种苿┦菇M蛋白H3K9的乙?；潭壬遊17]，進而提高干擾素調節因子(Interferon regulatory factor，IRF)介導Ⅰ型干擾素的表達，所以VPA可能通過提高IRF介導Ⅰ型干擾素的表達，導致NF-κB通道活性降低，引起干擾素α(Interfenron-α，IFN-α)、干擾素β(Interferon-β，IFN-β)的表達量升高，從而使信號轉導與轉錄激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)信號通路活性增強，進而引起M1型巨噬細胞的標記基因IL-6、iNOS、CCL-2表達量降低，與此同時，組蛋白H3K9的乙?；潭壬咭院?，使STAT6、 IRF4和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)信號通路活性減弱，進而使M2型巨噬細胞表達的抗炎性基因Arginase、Fizz-1、CD206、Ym1表達量增多。

另一方面，研究表明組蛋白H3K9乙?；c活化基因相關，屬促進性修飾，參與基因的轉錄激活，在巨噬細胞可塑性中起著重要作用。組蛋白修飾和核小體重塑與 T 細胞的基因表達密切相關，其轉錄后修飾常通過改變染色質結構和染色質的可接近性，從而促進或抑制轉錄因子與 DNA 的結合，進而調控基因的表達[5]。通過組蛋白修飾引起的染色質重塑，是特異性免疫反應中重要的表觀遺傳學機制[18]。

與此同時，實驗中發現，去乙酰化酶抑制劑VPA作用后的M1型巨噬細胞的標記基因CD86的表達量反而升高。去乙?；敢蕾囆跃奘杉毎泊碳し肿拥谋磉_可能與組蛋白去乙?；?1抗體有關，因為有研究已經發現這個去乙?；傅漠愇槐磉_能夠促進巨噬細胞中CD40和CD86的表達，但具體機制還不清楚[16]。

總而言之，去乙?；敢种苿┛梢酝ㄟ^調節多種重要途徑來有效規劃巨噬細胞平衡的不同方面[15]。這表明組蛋白H3K9的修飾和巨噬細胞的極化過程有著密切的聯系，因此我們可以通過控制巨噬細胞的組蛋白修飾，對巨噬細胞極化的某些關鍵步驟加以合理干預，扭轉巨噬細胞已偏移的極化失衡狀態，即使其從M1表型向M2表型轉化，這將有可能從一些新的思路來治療多種免疫相關疾病。

參考文獻：

[1]Stout RD,Jiang C,Matta B,etal.Macrophages sequentially change their functional phenotype in response to changes in microenvironmental influences[J].J Immunol,2005,175(1)：342-349.

[2]Cho D,Kim MR,Jeong H,etal.Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages[J].Exp Mol Med,2014,46(7):e70.

[3]謝冰冰，董燕，吳陽陽，等.巨噬細胞極化的信號通路及其與疾病的關系[J].中藥新藥與臨床藥理，2014,25(1)：107-112.

[4]Dalton DK,Pitts-Meek S.Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes[J].Science,1993,259(5102):1739-1742.

[5]Carlin JM,Ozaki Y,Byrne GI,etal.Interferons and indolea mine 2,3-dioxygenase:role in antimicrobial and antitumor effects[J].Experientia,1989,45(6):535-541.

[6]Nathan CF,Murray HW,Wiebe ME,etal.Identification of interferon-gamma as the lymphokine that activates human macrophage oxidative metabolism and antimicrobial activity[J].J Exp Med,1983,158(3):670-689.

[7]Goerdt S,Politz O,Schledzewski K,etal.Alternative versus classical activation of macrophages[J].Pathobiology,1999,(5-6):222-226.

[8]Maresz K,Ponomarev ED,Barteneva N,etal.IL-13 induces the expression of the alternative activation marker Ym1 in a subset of testicular macrophages[J].J Reproduct Immunol,2008,78(2):140-148.

[9]Gordon S.Alternative activation of macrophages[J].Nat Rev Immunol,2003,3(1):23-35.

[10]Solinas G,Schiarea S,Liguori M,etal.Tumor-conditioned macrophages secrete migration-stimulating factor:a new marker for m2-polarization,influencing tumor cell motility[J].J Immunol,2010,185(1):642-652.

[11]Stein M,Keshav S,Harris N,etal.Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity:a marker of alternative immunologic macrophage activation[J].J Exp Med,1992,176(1)::287-292.

[12]DY V,JE G,AW S,etal.Human macrophage polarization in vitro:Maturation and activation methods compared[J].Immunobiology,2014,219(9):695-703.

[13]Kittan NA,Allen RM,Dhaliwal A,etal.Cytokine induced phenotypic and epigenetic signatures are key to establishing specific macrophage phenotypes[J].Plos One,2013,8(10):e78045.

[14]Lee J Y,Kim N A,Sanford A,etal.Histone acetylation and chromatin conformation are regulated separately at the TNF-alpha promoter in monocytes and macrophages[J].J Leukoc Biol,2003,73(6):862-871.

[15]周憲賓.巨噬細胞M1/M2極化分型的研究進展[J].中國免疫學雜志,2012,28(10):957-960.

[16]Shakespear MR,Halili MA,Irvine K,etal.Histone deacetylases as regulators of inflammation and immunity[J].Trends Immunol,2011,32(7):335-343.

[17]Adhya D,Dutta K,Kundu K,etal.Histone deacetylase inhibition by Japanese encephalitis virus in monocyte/macrophages:a novel viral immune evasion strategy[J].Immunobiology,2013,218(10):1235-1247.

[18]Ishii M,Wen H,Corsa CA,etal.Epigenetic regulation of the alternatively activated macrophage phenotype[J].Blood,2009,114(15):3244-3254.

[收稿2015-07-25]

(編輯張曉舟)

Effect of deacetylase inhibitor VPA on polarization of macrophages

ZHANGYing,BAILi,ZHANGWen-Lan,YINXue-Hong,ZHANGWei,PANGChun-Yan,WANGYong-Fu.

TheFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,InnerMongoliaUniversityofScienceandTechnology,Baotou014040,China

[Abstract]Objective:By analyzing the effect of deacetylase inhibitors on macrophage polarization process of histone modification,and the influence of the process of macrophage polarization,analysis deacetylase inhibitors whether have the effect on the activity of the macrophage polarization by altered histone modification of macrophages,in order to provide a new perspective for the treatment of autoimmune diseases.Methods: Using lipopolysaccharide(LPS) and interferon-γ(IFN-γ) to stimulate J774.1 cells for 24 h,and interleukin-4(IL-4)to stimulate J774.1 cells for 24 h.And 2 mmol/L valproic acid(VPA) was added in the induction process.Collecting J774.1 cells,fluorescent quantitation PCR assay and ELISA assay was used for the detection of specific markers of gene expression in macrophage polarization,flow cytometry and immunofluorescence assay for the detection of histone modifications.Results: J774.1 cells were polarized into M1 macrophages which were stimulated by LPS and IFN-γ for 24 h;and also J774.1 cells were polarized into M2 macrophages which were stimulated by IL-4 for 24 h.The degree of acetylation of H3K9 for M1 phenotype was increased after VPA treatment,the expression of interleukin-6(IL-6),inducible nitric oxide synthase(iNOS),and chemotactic factor(CCL-2)was decreased,and the expression of CD86 was increased.The degree of acetylation of H3K9 for M1 phenotype was also increased after VPA treatment，and also the expression of Arginase,Fizz-1,mannose receptor(CD206) and Ym1 were increased.Conclusion: The polarization state of the macrophages and histone modification had a certain relevance.VPA could induce the transformation of M1 phenotype to M2 phenotype in the induction system of the M1 macrophages,however,the expression of specific genes in M1 phenotype was inhibited in the induction system of the M2 macrophages.

[Key words]Histone modification;Macrophage polarization；Deacetylase inhibitor；M1 macrophages;M2 macrophages

中圖分類號R392.12

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0307-07

作者簡介：張穎(1988年-)，女，在讀碩士，主要從事組蛋白修飾和細胞之間關系的研究，E-mail：1037842189@qq.com。通訊作者及指導教師：王永福(1968年-)，男，教授，碩士生導師，主要從事自身免疫性疾病的研究，E-mail：wyf5168@hotmail.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.003

①本文受2014年度國家自然科學基金委員會資助項目(No.81450040)和2015年度國家自然科學基金委員會資助項目(No.81360464)資助。