N-乙酰半胱氨酸對野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓作用機制的基礎研究

韓　冰　孟　曉　卜培莉

(濟南市第六人民醫院重癥醫學科，濟南250200)

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N-乙酰半胱氨酸對野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓作用機制的基礎研究

韓冰孟曉①卜培莉①

(濟南市第六人民醫院重癥醫學科，濟南250200)

[摘要]目的：觀察N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)對野百合堿(Monocrotaline,MCT)誘導的肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)大鼠右心室重構的影響及其機制。方法： Wistar雄性大鼠適應性喂1周，隨機分為正常對照組、MCT 組、MCT+NAC組。MCT(60 mg/kg)皮下注射誘導PAH大鼠模型，實驗組給予NAC[500 mg/(kg·d)]，連續6周，第4周末測定大鼠平均肺動脈壓(mPAP)、右心室收縮壓(RVSP)；分離大鼠左心室+室間隔(LV+S)、右心室(RV)并稱重，計算RV/(LV+S)的比值。HE染色觀察右心室病理學變化，天狼星紅染色觀察右心室膠原沉積的變化。RT-PCR和Western blot檢測右心室collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)、核轉錄因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)mRNA和蛋白表達。結果：NAC連續給藥4周后能明顯降低MCT誘導的PAH大鼠RVSP及mPAP，減輕RV/(LV+S)的比值，改善右心室心肌細胞的病理變化，降低右心室膠原的沉積，抑制NOX4的表達和NF-κB的活化。結論：NAC能緩解野百合堿(MCT)誘導的肺動脈高壓大鼠右心室重建，其機制可能是通過抑制NOX4介導的氧化應激損傷，和NF-κB 所介導的膠原沉積有關。

[關鍵詞]N-乙酰半胱氨酸；野百合堿；肺動脈高壓

肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種危害人類健康的非常嚴重的疾病，其形態學特征是肺小動脈血管結構重建，主要引起肺動脈壓力升高、肺血管阻力增加、右心衰竭[1]。其主要病理機制是炎癥和氧化應激的損傷相互促進的惡性循環過程[2]。大量研究表明氧化應激是引起 PAH 右心重構的重要原因，其中 NADPH 氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)誘導的氧化應激損傷參與了PAH 右心室重構[3,4]。另外有研究發現核轉錄因子κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)的活化參與PAH 心血管重構[5]，而NOX4介導的氧化應激可能通過增強對NF-κB的抑制蛋白IκB(Inhibitorka-ppa B)的解離，激活NF-κB與DNA的結合活性,進一步激活NF-κB轉錄因子[6]，促進生長因子、趨化因子、細胞因子、炎癥介質和黏附分子等相關基因表達，參與了PAH心血管重構[7]。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是從半胱氨酸衍生而來的一種氨基酸，具有調節細胞的代謝活性、清除氧自由基；調整基因的表達和信號轉導系統、抑制惡性腫瘤發展、預防DNA損傷等作用[8]。目前其抗炎和抗氧化應激作用已經廣泛應用于臨床各種疾病，例如對乙酰氨基酚中毒、特發性肺纖維化、支氣管炎、缺血再灌注損傷、心肌損傷等[9]。最近研究報道，N-乙酰半胱氨酸通過抑制肺損傷模型大鼠中促炎因子TNF-α和IL-1β的釋放以及NF-κB的激活，進而減少炎性細胞的釋放并且改善白細胞和單核細胞的化學驅藥性[10,11]。這些研究表明NAC具有保護機體免于氧化應激的損傷和右心室重構。

基于NAC的生物學功能，本實驗提出這樣的假設：NAC可能可以有效改善肺動脈高壓患者的肺血管的重建。本實驗通過體外注射MCT誘導并構建肺動脈高壓大鼠模型，同時給予肺動脈高壓大鼠NAC治療，研究NAC對肺動脈高壓大鼠的影響。

1材料與方法

1.1材料Wistar雄性大鼠，體重200～220 g，由華中科技大學動物實驗中心提供，實驗所用動物均符合國家醫用動物使用標準(許可證號：SCXK[鄂]2012-2014，級別：SPF)，野百合堿(MCT)(Sigma，美國)，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)(Sigma，美國)，TRIzol RNA 提取試劑盒(美國 Invitrogen 公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit、Power SYBR Green PCR Master Mix(大連寶生物工程有限公司)；collagenⅠ及 collagenⅢ單克隆抗體(美國 Abcam 公司)，β-actin、NOX4 及 NF-κB 單克隆抗體(美國 SantaCruz 公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組60只雄性大鼠隨機分為3組：①野百合堿誘導和N-乙酰半胱氨酸處理組(MCT+NAC，n=20)：本組大鼠首先給予MCT(60 mg/kg)皮下注射，每日一次，連續2周，同時給予NAC500 mg(kg·d)皮下注射，連續6周；②野百合堿誘導組(MCT，n=20)：本組大鼠實驗前2周給予MCT(60 mg/kg)皮下注射，每日一次，同時自實驗開始給予同NAC等體積的0.9%生理鹽水皮下注射，每天一次，持續6周；③生理鹽水對照組(n=20)：自實驗開始至實驗第6周給予同NAC等體積的0.9%生理鹽水皮下注射，每天一次，另外實驗開始前2周給予同MCT等體積的0.9%生理鹽水皮下注射，每天一次。

1.2.2血流動力學指標的測定自實驗開始，4周末對各組大鼠進行右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈壓(mPAP)、右心室肥厚指數(RVHI)檢測。分別于第2、4、6周用戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉。分離右頸外靜脈，采用肝素鈉導管經右頸外靜脈行右心插管，調整并妥善固定導管位置后，用MedLab多導生理記錄儀分別記錄。

1.2.3組織標本收集與處理上述動力學指標檢測完畢后，處死大鼠后迅速開胸分離心臟，預冷的PBS沖洗干凈，隨后準確分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+S)，稱重，計算RVHI=RV/(LV+S)。取右心室心尖部固定于4%多聚甲醛以備石蠟切片；剩余的右心室組織，-80 ℃冰箱保存，以備于相關指標的mRNA、蛋白表達水平的檢測。

1.2.4右心室組織病理學及膠原沉積的觀察取大鼠右心室心尖部4% 多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋切片，進行HE染色和天狼星紅染色，分別觀察右心室心肌細胞的病理變化及膠原沉積情況。

1.2.5RT-PCR檢測右心室collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、NOX4、NF-κB mRNA的表達稱重100g右心室組織，用1 ml Trizol 充分裂解組織后，氯仿抽提，異丙醇沉淀回收總RNA，測RNA濃度、逆轉錄后，所得cDNA以β-actin為內參照，在ABI-7300實時熒光定量PCR儀進行檢測。重復3次。數據分析用 7300 System SDS Software 軟件，統計ΔΔCt值。引物購買于美國origene公司，序列見表1。

表1引物序列

Tab.1Primer sequences

GenePrimersequenceCollagenⅠForwardsequence:CCTCAGGGTATTGCTGGACAACReversesequence:CAGAAGGACCTTGTTTGCCAGGCollagenⅢForwardsequence:GACCAAAAGGTGATGCTGGACAGReversesequence:CAAGACCTCGTGCTCCAGTTAGNOX4Forwardsequence:CGGGATTTGCTACTGCCTCCATReversesequence:GTGACTCCTCAAATGGGCTTCCNF-κBForwardsequence:CCAGGAGAAAGTCAGCCTCCTReversesequence:TCATACCAGGGCTTGAGCTCAβ-actinForwardsequence:CATTGCTGACAGGATGCAGAAGGReversesequence:TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG

1.2.6Western blot 檢測右心室 NOX4 和 NF-κB 蛋白表達低溫提取右心室蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg總蛋白與上樣緩沖液充分混合后，95℃加熱5 min，SDS-PAGE膠上電泳，轉膜，5%BSA封閉1 h，分別加入1∶500～1∶2 000稀釋后的相應的一抗，4℃孵育過夜。次日，充分洗滌后，分別加入相應HRP標記的二抗(稀釋比例為1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL凝膠成像系統(ECL,USA)采集圖像。實驗獨立重復3次。

2結果

2.1NAC對肺動脈高壓大鼠血流動力學和右心室肥厚的影響與對照組比較，MCT誘導組大鼠在MCT皮下注射第4周末RVSP、mPAP明顯增高，差異有統計學意義。因 RV/LV+S即(RVHI)是評價右心室肥厚程度的主要指標。與對照組相比，在MCT處理第4周末，MCT處理組RVHI明顯增高(P<0.01)。而給予NAC治療組，于治療的第4周末，可以觀察到RVSP、mPAP、RV/LV+S的明顯改善，較MCT處理組均顯著降低，差異有統計學意義。結果見表2。

2.2NAC對肺動脈高壓大鼠右心室心肌細胞的病理變化和右心室膠原表達的影響右心室心肌細胞HE染色后400倍鏡下觀察，與對照組相比，野百合堿(MCT)處理組右心室心肌細胞增生肥大且排列紊亂、稀疏和胞漿腫脹，心肌細胞間隙增寬，而給予NAC治療后于第4周末，可觀察到上述病理變化有明顯的改善，結果見圖1A。同時天狼星紅染色觀察右心室膠原的表達，天狼星紅染色顯示膠原纖維為紅色，可以觀察到對照組右心室著色較淡，心肌細胞的間隙清晰可見，血管旁膠原分布稀疏。與對照組相比，MCT處理組大鼠右心室心肌細胞間質有較多明顯紅色膠原沉積；而NAC治療組右心室心肌細胞間質和血管旁的紅色深染較MCT組逐漸減少，膠原沉積現象也明顯減輕。結果見圖1B。

表2血流動力學數據

Tab.2Hemodynamic data

ControlMCTPNACp1RVSP(mmHg)40.52±5.24112.63±16.450.00170.23±12.340.03mPAP(mmHg)10.23±1.0240.78±4.760.0128.33±5.210.04RVHI0.28±0.030.72±0.070.010.41±0.090.02

圖1　NAC對MCT誘導肺動脈高壓大鼠右心室病理變化以及膠原沉積的影響Fig.1　NAC decreases cardiomyocytes hypertrophy and fibrosis in RV rats with PAHNote: In the first part(A),representative image of cardiomyocytes in RV of control rat(1)，MCT rats(2) and MCT rats treated with NAC after MCT exposure(3);in the second part(B),representative image of collagen(red stained)content in RV of control rat(1) MCT rats(2)and MCT rats treated with NAC after MCT exposure(3).

圖2　NAC對右心室collagenⅠ、 collagen Ⅲ mRNA表達的影響Fig.2　Expression of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ mRNA was determined by RT-PCR in right ventricle of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypert-ension of ratsNote: Comparison between two groups，*.P<0.01.

圖3　NAC對右心室NOX4、NF-κB表達的影響Fig.3　Expression of NOX4 and NF-κB was deter-mined by RT-PCR and Western blot in right ventricle of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension of rats after NAC treatmentNote: Comparison between two groups，*.P<0.01.

2.3NAC對右心室collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA表達的影響經RT-PCR檢測發現，MCT處理組右心室collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA的表達較對照組明顯增高。而與MCT組對比，NAC治療組治療第4周末collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表達均有不同程度的下調，差異有統計學意義。結果見圖2。

2.4NAC對右心室NOX4、NF-κB表達的影響經RT-PCR、Western blot檢測發現，MCT處理組右心室NOX4、NF-κB mRMA、蛋白水平的表達均較對照組明顯增高。而與MCT組對比，NAC治療組治療第4周末NOX4、NF-κB mRNA、蛋白的表達均有不同程度的下調，差異有統計學意義。結果見圖3、4。

3討論

隨著學者們對PAH病理生理學機制和發病機制的深入研究，臨床上對PAH的治療也在不斷改進。以前臨床上主要是使用磷酸二酯酶-5抑制劑和內皮素受體拮抗劑等藥物的治療來改善患者的預后。目前更多新的治療藥物隨著對PAH研究的深入不斷被學者們提出并應用。

N-乙酰半胱氨酸最早在臨床上用于治療急性咳嗽，使痰中的黏蛋白裂解，降低分泌液的黏性而利于排出。隨著近年來對N-乙酰半胱氨酸的深入研究，發現NAC還具有多種其他功能，如較強的抗炎、抗氧化、擴血管等多種生物活性，對呼吸系統疾病、肝炎、心血管疾病、腫瘤等有潛在的治療作用。Gerrits等[12]收集1 219例慢性阻塞性肺疾病的患者資料進行臨床研究，發現NAC可減少大約30%的COPD患者再住院風險，且這種療效呈劑量依賴性。另外有研究顯示NCA通過補充孤立心肌細胞內容谷胱甘肽，從而消除TNF-α對心臟的有害作用。NAC還可以改善肝功能衰竭患者的生存率主要機制如下：(1)增加NO的產量；(2)提高GSH的生物利用度；(3)調節淋巴細胞活性，抑制T細胞凋亡，使肝細胞的功能增強；(4)抑制重型肝炎患者炎癥因子IL-8、NO和sicAM-1等的分泌，減少肝臟損傷[13]。

本研究通過野百合誘導，構建PAH大鼠模型，并給予NAC處理，結果顯示NAC連續給藥4周末，PAH大鼠的RVSP、mPAP、RV/LV+S顯著降低；右心室心肌細胞的病理損傷明顯減輕,膠原沉積明顯并且膠原蛋白的表達顯著下調，這些均提示NAC對PAH 大鼠具有降低肺動脈壓力、減輕右心室重構和膠原沉積的作用。

肺動脈高壓主要形態學改變是肺血管和右心室重構，目前其機制不是很明確。有研究發現NOX可以通過誘導氧化應激反應影響肺動脈高壓患者肺血管重構及右心重構[14,15]。最近有學者研究發現在野百合堿誘導的PAH大鼠右心室NOX4表達明顯增高，并且給予白楊素治療后能夠抑制NOX4的表達，從而減輕MCT誘導的肺動脈高壓大鼠右心室病理變化和膠原沉積[16]。我們實驗結果表明野百合誘導的PAH大鼠右心室NOX4的mRNA和蛋白水平均明顯增高，同時給予N-乙酰半胱氨酸皮下注射治療，4周后，PAH大鼠右心室NOX表達顯著降低。這些結果與之前學者們的研究是一致的，表明NAC通過下調NOX4的表達而抑制PAH大鼠右心室重構。

NF-κB 是一種核轉錄因子，參與生物體內很多重要的生理反應過程。其中NF-κB 的活化在氧化應激損傷誘導肺動脈高壓的形成進程中發揮重要作用[17,18]。而大量的研究表明NAC可以通過抑制NF-κB活化而實現抗炎、抗氧化等作用[19-21]。本研究結果發現,野百合堿誘導的 PAH 大鼠右心室 NF-κB的表達顯著增高,而給予NAC皮下注射4周后能下調大鼠右心室 NF-κB mRNA 及蛋白的表達,表明NAC通過抑制NF-κB 活化從而保護PAH大鼠肺血管和右心室重構。

綜上所述，NAC能夠緩解MCT誘導的肺動脈高壓大鼠肺血管和右心室的重構，其機制可能與抑制NOX4的表達和降低氧化應激損傷誘導的NF-κB活化有關。

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[收稿2015-11-06修回2016-01-29]

(編輯許四平)

·啟事·

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《中國免疫學雜志》編輯部

Effect of N-acetylcysteine in right ventricle of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension of rats

HANBing,MENGXiao,BUPei-Li.

DepartmentofICU,Ji′nanSixthPeople′sHospital,Ji′nan250200,China

[Abstract]Objective:To investigate the protective effect of N-acetylcysteine(NAC)on right ventricular remodeling in a rat model of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension(PAH).Methods: PAH rats were induced by a single injection of monocrotaline(60 mg/kg,sc)and were ad ministered with NAC[500 mg/(kg·d)]for 6 weeks.At the end of 4 weeks,the right ventricular systolic pressure(RVSP)and mean pulmonary artery pressure(mPAP)were monitored via the right jugular vein catheterization into the right ventricle.Right ventricle(RV)to left ventricle(LV)+septum(S)were calculated.Right ventricular morphological change was observed by HE staining.Sirius red was used to demonstrate collagen deposition.The expressions of collagen Ⅰ,collagen Ⅲ,NADPH oxidase 4(NOX4)and nuclear factor-kappa B(NF-κB)were analyzed by RT-PCR and(or) Western blot.Results: NAC attenuated RVSP,mPAP and right ventricular remodeling index(RV/LV+S) of PAH rats induced by monocrotaline after treatment for 4 weeks.Furthermore,monocrotaline-induced right ventricular collagen accumulation and collagen Ⅰ and collagen Ⅲ expression were both significantly suppressed by NAC.The expressions of NOX4 and NF-κB were obviously decreased in right ventricule from PAH rats with NAC treatment.Conclusion: NAC ameliorates right ventricular remodeling of PAH induced by monocrotaline in rats through down regulating the expression of NOX4 and antioxidant activity,and inhibiting activation of NF-κB and collagen accumulation.

[Key words]N-acetylcysteine;Monocrotaline;Pulmonary arterial hypertension

中圖分類號R332

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0345-05

作者簡介：韓冰(1979年-)，女，在讀碩士，主治醫師，主要從事肺動脈高壓、冠心病、心律失常等相關疾病的診治工作，E-mail：hanbing368@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.011

①山東大學齊魯醫院心內科，濟南250012。