冬蟲夏草菌絲體提取物調控免疫改善腎纖維化的實驗研究

岳會敏　劉　飛　李范林　馬菲雅　沈蘇南　侯亞義

(南京大學醫學院和生物醫藥技術國家重點實驗室，南京210093)

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冬蟲夏草菌絲體提取物調控免疫改善腎纖維化的實驗研究

岳會敏劉飛李范林馬菲雅沈蘇南侯亞義

(南京大學醫學院和生物醫藥技術國家重點實驗室，南京210093)

[摘要]目的：觀察冬蟲夏草菌絲體(Hirsutella sinensis mycelium，HSM)提取物對盲腸穿孔結扎(CLP)小鼠的免疫反應和腎纖維化程度的影響。方法：建立CLP誘導膿毒癥小鼠模型，分為假術組(sham,n=5)、模型組(CLP,n=11)、治療組(HSM,n=11)。冬蟲夏草菌絲體組在術前2小時和術后10天給予HSM提取物200 mg/(kg·d),假術組和模型組給予等量的生理鹽水。利用流式細胞術分析了小鼠外周血中巨噬細胞、中性粒細胞和Treg細胞數量以及腹水中巨噬細胞數量；利用Q-PCR檢測了腎臟組織中炎性因子TNF-α和IL-1β及纖維化因子TGF-β1、TIMP1和MMP9的表達；另外，還對腎臟組織切片進行了HE染色以及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和纖連蛋白(fibronection)免疫組化染色。結果：模型組外周血中巨噬細胞、中性粒細胞和腹水中巨噬細胞數量較假術組顯著升高,而HSM提取物治療能下降上述細胞的數量；與正常組相比，模型組和治療組外周血中Treg細胞數量均無明顯差異；模型組腎臟組織中炎性因子TNF-α和IL-1β及纖維化因子TGF-β1、TIMP1和MMP9表達均上調，而治療組腎臟上述細胞因子表達都有顯著降低；HE染色顯示模型組腎臟組織炎性樣變明顯，而治療組有較好改善；與假術組比，模型組腎小管及間質α-SMA和fibronection表達明顯增多，而治療組腎小管及間質表達低于模型組。結論：HSM提取物具有調控免疫及改善腎纖維化的功能。

[關鍵詞]冬蟲夏草菌絲體；盲腸穿孔結扎；免疫反應；纖維化

腎纖維化是各種慢性腎臟病發展為終末期腎臟病的共同途徑[1]，其實質是細胞外基質(ECM)的大量沉積。大多腎纖維化都會誘導腎臟炎癥反應，而未被及時調控的炎性反應又會促進腎纖維化的進程[2]；腎臟炎性反應涉及免疫細胞和腎臟固有細胞產生和分泌促纖維化細胞因子和生長因子，這些細胞因子可以促進纖維化病程[3]。減緩和阻止腎纖維化是腎臟病治療的重要環節，但由于其病理機制復雜，目前為止現代醫學仍缺乏良好的臨床治療手段。

冬蟲夏草菌絲體是我國傳統名貴中藥，它是真菌寄生在蝙蝠蛾幼蟲上的干燥子座和蟲體；許多臨床經驗顯示冬蟲夏草菌絲體可延緩各種慢性腎臟病的進展，但對其具體作用機制的研究有限。近年來的研究表明冬蟲夏草菌絲體具有免疫調控、抗腫瘤、抗病毒和保護肺及腎臟等功能[4-7]。本研究的主要目的是進一步明確冬蟲夏草菌絲體調控免疫反應、改善腎纖維化的作用，并研究其可能的機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物的購置飼養4～6周C57BL/6小鼠，雄性,體重18～20 g,購于南京大學模式動物所，飼養于SPF級動物房內，保證飲食和飲水，晝夜循環，使用前飼養1周。

1.1.2藥物與試劑冬蟲夏草菌絲體提取物由南京中科藥業有限公司提供，批號：20140778；免疫組化所用fibronectin抗體購自SANTA CRUZ公司，1∶50稀釋 ；α-SMA抗體是abcam公司產品，1∶200稀釋；DAB顯示試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，產品編號：AR1022；SABC-AP免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，產品編號：SA1050；實驗用流式抗體均為eBioscience產品。

1.1.3實驗動物處理27只小鼠在SPF級動物房飼養1周后，隨機分組，實驗分組如下：(1)sham組：小鼠腹腔注射100 μl/10 g生理鹽水，2 h后用4%水合氯醛(200 μl/每只)麻醉小鼠打開腹腔暴露盲腸，不結扎不穿刺，然后將盲腸放入腹腔，逐層關閉腹腔，縫好傷口；每組5只小鼠。(2)實驗組：①CLP組：小鼠腹腔注射100 μl/10g生理鹽水，2 h后用4%水合氯醛(200 μl/每只)麻醉小鼠打開腹腔抽出盲腸結扎穿刺，之后將盲腸放入腹腔逐層關閉腹腔，縫好傷口；每組11只小鼠； ②治療組：冬蟲夏草菌絲體液(200 mg/kg)預處理2 h，隨后進行CLP手術，術后每天菌絲體液(200 mg/kg)灌胃，每組11只小鼠，術后10 d處死小鼠。

1.2方法

1.2.1流式細胞術將收集的細胞用PBS洗3遍，然后用PBS重懸并轉移至標準BD流式管中，按抗體說明書加入相應用量的流式抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗兩次，重懸細胞后使用流式細胞儀檢測。標記胞內因子的，PBS洗兩遍后，加500 μl 4%的PFA室溫固定20 min，離心去上清；加500 μl 含0.1%saponin的PBS，破膜15 min，離心去上清；按抗體說明書加入相應用量的流式抗體，4℃避光孵育30 min，然后用含0.1% saponin的PBS洗2遍，重懸細胞后上流式細胞儀檢測。

1.2.2Q-PCR將腎臟組織勻漿后，加入Trizol，提總RNA，核酸蛋白檢測儀檢測RNA的純度和濃度后，取1 g RNA進行反轉錄。反轉錄體系(20 μl)：4 μl 5×RT buffer，2 μl dNTP，0.5 μl RNase inhibitor，0.5 μl Oligo dT，0.5 μl ReverTra Ace，1 μg RNA，加DEPC水至20 μl；采用三步法進行Q-PCR反應，反應在Applied BioSystems 7300 Sequence Detection System中進行，得到各個基因的Ct值，然后以GAPDH為內參，按照2-ΔΔCt進行計算確定目的基因的表達。其中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP9和TIMP1引物均按primer bank查詢設計合成，GAPDH引物根據文獻合成。

1.2.3組織學觀察肺組織取出后用4%多聚甲醛固定，常規HE染色，切片在光學顯微鏡10×20視野下觀察腎小球和腎小管形態變化。

1.2.4免疫組化染色石蠟切片脫蠟、水化后，熱修復；冷卻后，3%H2O2阻斷過氧化氫酶；PBS洗三遍，然后按抗體說明書滴加適當濃度的一抗，4℃孵育過夜；按說明書滴加適量二抗，37℃孵育45分鐘后，用PBST洗三遍，加底物SABC 37℃孵育20 min；隨后用PBST洗四遍，DAB(武漢博士德生物公司)顯色；復染透明后封片；在光學顯微鏡10×20視野下觀察。

2結果

2.1冬蟲夏草菌絲體提取物對小鼠免疫細胞數量的影響本實驗主要研究了HSM提取物對小鼠外周血中巨噬細胞、中性粒細胞、Treg 細胞以及腹水中巨噬細胞數量的影響。流式細胞術結果顯示：與sham組相比，CLP組小鼠外周血巨噬細胞和腹水中巨噬細胞數量均顯著增多(P<0.05)，分別見圖1A和圖1B；與CLP組相比，給予HSM提取物治療后，小鼠外周血和腹水中巨噬細胞數量明顯降低(P<0.05)；與sham組相比，CLP組小鼠外周血中性粒細胞數量顯著增多(P<0.05)；與CLP組相比，給予HSM提取物治療后，小鼠外周血中性粒細胞數量有所降低(P<0.05)，見圖1；Sham組、CLP組和治療組小鼠外周血中Treg細胞均無顯著差異，見圖2。

2.2冬蟲夏草菌絲體對腎臟炎性反應的影響Q-PCR結果顯示，與sham組相比，CLP組小鼠腎臟重要的炎性因子IL-1β的mRNA的表達升高(P<0.01)，而HSM治療組IL-1β的mRNA表達相比CLP組明顯降低(P<0.05)；CLP組小鼠腎臟TNF-α的mRNA表達也較sham組升高，給予HSM提取物治療后降低，見圖3A。

腎組織HE染色顯示，模型組小鼠的腎小管及間質出現炎性細胞浸潤、系膜基質增生,血管充血等變化；給予HSM提取物治療后，上述癥狀減輕。以上結果說明冬蟲夏草菌絲體改善了小鼠腎臟炎性病變，見圖3B。

圖1　HSM影響小鼠免疫細胞數量(n=3)Fig.1　HSM influences amounts of mice′s immunocytes (n=3)Note: *.P<0.05,**.P<0.01.

圖2　HSM不影響小鼠外周血Treg細胞數量(n=3)Fig.2　HSM dose not affect the amount of Treg in mice′s PBMC (n=3)

2.3冬蟲夏草菌絲體對腎臟纖維化分子表達的影響Q-PCR結果顯示，CLP組小鼠腎臟TGF-β1、金屬基質蛋白酶9(MMP9)和金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP1)的mRNA表達均顯著上調，提示CLP組小鼠腎臟可能出現纖維化病變；而HSM治療組小鼠腎臟TGF-β1、MMP9和TIMP1的表達與CLP組相比均有下降，提示小鼠腎臟ECM的合成和降解失衡得到控制、腎纖維化病變可能得到改善。見圖4A。

2.4冬蟲夏草菌絲體對腎臟α-SMA和fibronectin蛋白表達影響sham組小鼠腎小管、腎小球及間質罕見α-SMA和fibronectin表達，然而CLP模型組小鼠的腎小球、腎小管及間質均有大量α-SMA和fibronectin表達，而經過HSM提取物治療后，腎小球、腎小管及間質中兩種蛋白的表達明顯減少。見圖4B。

圖3　HSM改善小鼠腎臟炎性反應(n=3)Fig.3　HSM can improve inflammation in mice′s renal sections(n=3)Note: HE staining was performed on renal sections.Original magnification，×20.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖4　HSM改善小鼠腎纖維化情況(n=3)Fig.4　HSM can improve mice′s renal fibrosis(n=3)Note: Immunohistochemical staining was performed on renal sections.Original magnification,×20.*.P<0.01,**.P<0.001.

3討論

腎纖維化是多種慢性腎病的病理過程，以腎臟組織破壞、腎臟功能喪失以及過量ECM在腎間質積聚為特征。腎纖維化涉及炎癥反應、免疫細胞和腎臟固有細胞合成分泌促纖維化細胞因子等環節。

炎癥反應是各種慢性腎臟病的基本病理現象，當腎臟受到損傷刺激時，腎臟固有細胞活化并釋放趨化因子，招募免疫細胞浸潤到損傷組織。近些年的研究對于巨噬細胞的研究最多，很多臨床數據和實驗報道都說明各種腎臟病均開始于巨噬細胞浸潤到腎間質。Tsung-Teng Huang等發現冬蟲夏草菌絲體不僅能夠在體外抑制LPS處理的巨噬細胞分泌IL-1β、IL-18等，而且能減少caspase-4的活化，證明其具有抗炎活性[8]。本研究中外周血巨噬細胞數量、腹水巨噬細胞數量、腎臟炎性因子TNF-α和IL-1β的mRNA水平表達量以及腎臟HE染色結果均提示，冬蟲夏草菌絲體能夠降低巨噬細胞數量、顯著改善小鼠炎性細胞浸潤情況和降低腎臟炎性因子的表達，證實蝙蝠蛾被毛孢菌絲體具有阻斷炎癥反應和調節腎臟微環境的功能。

ECM合成和降解失衡導致ECM在腎間質過量積聚，形成纖維化。MMPs和TIMPs與維持腎臟ECM的合成和降解密切相關，本研究中HSM治療組小鼠腎臟MMP9和TIMP1的mRNA表達水平均降，證實了冬蟲夏草菌絲體改善腎功能及抗腎纖維化的作用。低隨著對腎纖維化的研究進展，上皮細胞向間質轉化(EMT)漸漸受到人們關注，EMT時，腎上皮細胞失去其上皮細胞本身的特性，進入間質，變成肌成纖維細胞，而肌成纖維細胞也是細胞外基質的重要來源[9]。包括TGF-β在內的多種細胞因子都能促進EMT。YANG J等發現單側輸尿管梗阻的大鼠腎臟細胞同時表達上皮細胞標志物E-cadherin和肌成纖維細胞標志物α-SMA，說明腎纖維化中存在上皮細胞向間質細胞轉化[10，11]。本研究中治療組小鼠腎臟TGF-β1的mRNA水平表達量下降，免疫組化結果也表明給予HSM提取物治療后小鼠腎臟α-SMA和fibronectin 表達均下降，說明小鼠腎臟EMT得到改善，冬蟲夏草菌絲體具有抗纖維化功能。

本研究結果證實冬蟲夏草菌絲體能夠調控免疫改善腎纖維化，對此進行深一步研究將有利于闡明其抗纖維化的作用機制，為尋找抗腎纖維化藥物提供新視角。

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[收稿2015-09-17修回2015-10-20]

(編輯許四平)

An experimental study on effects of Hirsutella sinensis mycelium (HSM) extract on immunoregulation and kidney fibrosis

YUEHui-Min,LIUFei,LIFan-Lin,MAFei-Ya,SHENSu-Nan,HOUYa-Yi.

MedicalSchool&StateKeyLaboratoryofPharmaceuticalBiotechnology,NanjingUniversity,Nanjing210093,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of HSM on the immunoreaction and renal fibrosis in mice with cecal ligation and puncture (CLP).Methods: Renal fibrosis was induced by CLP;mice were divided into three groups,including sham group (sham,n=5),model group (CLP,n=11),therapy group (HSM,n=11).HSM extract [200 mg/(kg·d)] was orally administered to HSM group 2 hour before surgery and repeated everyday throughout 10 days,while sham group and model group were given the same dose of normal saline.FACS assay was used to analyze the amount of macrophages,neutrophils and Treg in PBMC,as well as macrophages in peritoneal fluid;we used Q-PCR assay to analyze the expression of inflammatory molecules (IL-1β and TNF-α) and fibrogenic cytokines (TGF-β,MMP9 and TIMP1) from renal sections.Besides,renal sections were subjected to HE stain and immunohistochemical staining with α-SMA and fibronectin.Results: The amount of model group′s macrophages and neutrophils in PBMC,as well as macrophages in the peritoneal fluid were significantly higher than sham group′s,whereas HSM succeeded in lowering them;contrast to sham group,Tregs′ amount of CLP group and HSM group in PBMC had no significant changes.The expression of inflammatory molecules (IL-1β and TNF-α) and fibrogenic cytokines (TGF-β,MMP9 and TIMP1) from CLP group′s renal sections were remarkably improved,whereas HSM inhibited that.The CLP group′s HE results showed obvious renal inflammatory damage,whereas HSM reduced the histopathologic alterations;contrast to sham group,model group′s expression of α-SMA and fibronectin was remarkably improved,while HSM group showed lower expression.Conclusion: HSM extract could regulate immunity response and had effect in improving renal fibrosis.

[Key words]Hirsutella sinensis;CLP;Immunoreaction;Fibrosis

中圖分類號R392

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0354-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.013

作者簡介：岳會敏(1991年-)，女，碩士，主要從事細胞與分子免疫研究，E-mail:yuehuimin914@126.com 。通訊作者及指導教師：沈蘇南(1974年-),男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事細胞與分子免疫和腫瘤與生物治療方面的研究，E-mail:shensn@nju.edu.cn。