基于膠乳增強免疫比濁法的食物過敏原檢測試劑盒方法學的建立及臨床應用評價①

盧玲玲　鄭國軍　涂斐佩　吳海鷗　林曉瓊

(瑞安市中醫院檢驗科，瑞安325200)

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基于膠乳增強免疫比濁法的食物過敏原檢測試劑盒方法學的建立及臨床應用評價①

盧玲玲鄭國軍②涂斐佩吳海鷗林曉瓊

(瑞安市中醫院檢驗科，瑞安325200)

[摘要]目的：建立基于膠乳增強免疫比濁法的食物過敏原檢測試劑的方法并應用于臨床。方法：采用膠乳增強免疫比濁法，對檢測體系的標準曲線、最低檢測量、穩定性、精密度、干擾實驗等相關性能指標進行評價，通過檢測健康體檢人員及臨床過敏人群血液標本并與目前應用于臨床的較成熟的ELISA方法進行比對，評價膠乳增強免疫比濁法的食物過敏原檢測試劑的臨床應用可行性。結果：該方法的標準曲線Y=837.1x2-125.2x+10.036，線性范圍：0～400 U/ml，相關系數為0.996，最低檢測限為19.600 U/ml。批內、批間精密度均<10%。該方法的正常參考范圍為<33.5 U/ml，敏感度89.61%，特異性65.22%，準確度84.00%，陽性預示值89.61%，陰性預示值65.22%，ROC的曲線下面積(AUC)為0.957，該方法與目前應用較廣泛的ELISA法具有很強的相關性(r=0.890 2)。結論：膠乳增強免疫比濁法的食物過敏原檢測試劑符合臨床診斷的相關要求，可應用于臨床食物過敏性患者的診斷及疾病監測。

[關鍵詞]膠乳;免疫比濁;方法學;過敏原

過敏疾病為常見病、多發病，嚴重時可造成過敏性休克，甚至危及生命，約35%的過敏反應由食物誘發。其中我市近年來病史資料查詢顯示，蟹過敏人數較多，呈遞增趨勢。

本項目擬采用乳膠增強法進行國產化的蟹食物過敏原檢測試劑盒的開發。替代現有食物過敏原ELISA檢測試劑盒，此新型的產品可以用于遲發相食物過敏反應的臨床診斷，檢測食物過敏原，為預防和治療過敏反應，排除類似過敏癥狀慢性疾病的誤診提供輔助診斷依據。并且在此項目建立的基礎方法上我們將繼續展開其他類型食物過敏原的檢測項目。本項目的開展為加強食品安全檢測提供技術支持，提升我國食品安全的發展具有非常重要的意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標本選取2013年6月至2015年6月在瑞安人民醫院及瑞安市中醫院蟹過敏患者100例，健康體檢人員100例，采集他們的血清標本置-80℃冰箱保存備用。

1.1.2試劑和儀器主要試劑：浙江天科高新技術發展有限公司制備：蛋白緩沖液：25 mmol/L磷酸鹽緩液(pH7.2～7.4)，蟹蛋白過敏原致敏乳膠顆粒2.5 mg/ml；校準品人IgG(400 U/ml)購自杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司[校準品溯源自 WHO International Stardard :Immunoglobulins G, A and M, human serum (67/086)]；主要儀器：貝克曼庫爾特IMMAGE 800特定蛋白分析：美國。

1.2分析性能評價

1.2.1試劑穩定性檢測將標準品人IgG稀釋成5個濃度(0、50、100、200、400 U/ml)來驗證蟹蛋白過敏原致敏乳膠顆粒的穩定性。分別檢測蛋白緩沖液與致敏乳膠顆粒在37℃/7 d、4℃/30 d、4℃/180 d的穩定性。

1.2.2標準曲線將人IgG標準蛋白稀釋成0 U/ml(A)、6 U/ml(B)、30 U/ml(C)、150 U/ml(D)、400 U/ml(E)5個點，測試5次，由貝克曼庫爾特IMMAGE 800特定蛋白分析自帶軟件繪制蟹蛋白的檢測標準曲線。

1.2.3最低檢測限與空白值空白檢測限使用的是無蟹蛋白的血清標本；最低檢測限采用無過敏性疾病的健康體檢人員血清標本，稀釋5倍后檢測。最低檢測限與空白檢測標本均分為兩個批次，連續5 d檢測6次。本方法嚴格按照國際臨床化學標準委員會(NCCLS)EP17-A進行。

1.2.4分析不精密度分別檢測三個批次(標記為20150110、20150210和20150710)的試劑檢測三種蛋白高、低兩個濃度(200 U/ml，20 U/ml)各3次/d，連續20 d，分別計算批內及批間的變異系數。本方法嚴格按照國際臨床化學標準委員會(NCCLS)EP5-A2進行。

1.2.5交叉反應分別選擇雞蛋、蝦、牛奶的等食物IgG陽性、蟹IgG陰性的血清標本,與蟹蛋白過敏原致敏乳膠顆粒同時檢測，照上述實驗方法測定吸光度OD值，在同樣條件下同時檢測單一蟹IgG陽性的標本,作為基礎樣品測定值,計算與其他種類食物IgG的交叉反應情況。

1.2.6干擾實驗將相當于甘油三酯濃度為2.00、3.00、4.00、5.00 mmol/L的橄欖油乳劑，血紅蛋白含量為0.5、1.5、2.5、5 g/L的血紅蛋白溶血液加到蟹IgG濃度為200 U/L的血清中,測定蟹IgG濃度，將實際測定值與理論預期值相比較，以誤差大于10%為判斷標準，觀察脂血及溶血對該方法的影響。

1.2.7正常參考范圍檢測100份正常體檢無明顯臨床疾病血清標本[男∶女=60∶40，年齡(39.03±15.98)歲]，確定檢測蟹食物蛋白的正常參考范圍。

1.2.8方法學比較分別將100份蟹食物蛋白標本進行酶聯免疫吸附實驗(ELISA，儀器奧地利BioTek-Elx800，試劑批號：1505007)和PETIA(膠乳增強免疫比濁法)檢測，檢測結果進行線性回歸計算其相關系數

2結果

2.1蟹蛋白過敏原致敏乳膠顆粒的穩定性檢測試劑在37℃/7 d、4℃/30 d、4℃/180 d均保持穩定。結果見表1。

2.2最低檢測限與空白值最低檢測限(LoD)為19.600 U/ml，空白檢測限(LoB)為13.241 U/ml；(計算公式：LoD: 13.241±2×3.844, LoD=LoB+2SD LoB:7.102 7±3.711 3, LoB=average+2SD)。所有檢測數據均呈正態分布。

2.3檢測范圍與標準曲線以吸光度值OD為橫坐標,以IgG的濃度為縱坐標,進行標準曲線擬合,其劑量-反應曲線見圖1，標準曲線Y=837.1x2-125.2x+10.036相關系數為0.996，線性范圍為0～400 U/ml。

表1試劑穩定性

Tab.1Stability of reagent

Proposedconcentration37℃OD7dconcentration(U/ml)4℃OD30dconcentration(U/ml)37℃OD180dconcentration(U/ml)A(0U/ml)0.0237.590.0316.960.0138.55B(50U/ml)0.29244.850.31955.280.32457.35C(100U/ml)0.39189.060.40596.640.38988.00D(200U/ml)0.562204.070.582220.720.549193.60E(400U/ml)0.765404.150.761399.540.785427.60

表2批內精密度

Tab.2Results of intra-assay precision

Proposedconcentration(U/ml)20150110IgG(U/ml)CV(%)20150210IgG(U/ml)CV(%)20150710IgG(U/ml)CV(%)20.022.52±1.787.925.35±2.289.018.79±1.548.2200212.08±18.678.8190.95±15.288.0219.06±15.557.1

表3批間的精密度(n=3×8)

Tab.3Results of inter-assay precision (n=3×8)

Additionalconcentration(U/ml)IgG(U/ml)CV(%)20.025.88±1.716.6200209.69±17.048.3

表4不同食物間交叉反應率

Tab.4Cross-reactivity rate of different kinds of food

Antigentypescross-reactionrate(%)EggShrimpMilkSoybeanBeefPorkCrab6.137.313.022.783.252.56

表5蟹IgG(200 U/ml)濃度中加入干擾物后預測值與實測值的比較

Tab.5Comparison of predicted values and measured values after Crab IgG(200 U/ml ) joining distractors

Crab-IgGconcentration(U/ml)Triglycerideconcentration(mmol/L)2345Hemoglobinconcentration(g/L)0.51.52.55Predictedvalue200200200200200200200200Measuredvalue195189193179192193188175Error2.55.53.510.54.03.56.012.5

圖1　蟹蛋白過敏原膠乳免疫增強檢測法標準曲線Fig.1　Crab protein standard curve of PETIA

2.4精密度交叉反應高低兩個IgG濃度的變異系數(CV)分別為：批號20150110為7.9%和8.8%；批號20150210為9.0%和8.0%；批號20150710為8.2%,7.1%。批間變異系數分別為6.6%,8.3%；甘油三酯濃度在5.00 mmol/L以上，血紅蛋白濃度在5g/L以上對蟹IgG檢測濃度產生影響。見表2～5。

2.5參考范圍所有檢測數據均呈正態分布，其平均值為12.02 U/ml，標準差為10.753，得出膠乳免疫增強比濁法檢測血清特異性蟹IgG的95%可信區間為<33.5 U/ml。將血清中蟹特異性IgG值大于33.5 U/ml的患者認定為陽性。見圖2。

圖2　蟹血清特異性IgG正態分布圖Fig.2　Eyes crab serum specific IgG normal distribution

2.6ROC工作曲線收集100份蟹過敏性患者血清(男∶女=46∶54，年齡1～36歲)。結合臨床，共有77名患者確診為蟹過敏性疾病。膠乳免疫增強比濁法的敏感度89.61%，特異性65.22%，準確度84.00%，陽性預示值89.61%，陰性預示值65.22%(表6)。ROC的曲線下面積(AUC)為 0.957 (圖3)。

2.7方法學比較收集100份患者血清，用PETIA法以及臨床在用的ELISA法同時進行檢測?；貧w方程為Y=1.264x+27.599(Y為ELISA法結果，x為PETIA法結果)，相關系數為0.890 2(圖4)。線性回歸結果表明，兩者具有良好的相關性，該結果表明我們新創的PETIA法可用于臨床血清標本中蟹食物過敏原。

表6PETIA方法的敏感性和特異性

Tab.6Sensitivity and specificity of PETIA

ClinicaldiagnosisofallergiesTotal+-CrabIgG+69877-81523Total7723100

圖3　PETIA ROC曲線Fig.3　ROC curve of PETIA

圖4　ELISA和PETIA方法比較的線性回歸圖Fig.4　Comparison between ELISA and PETIA

3討論

膠乳增強免疫比濁法(PETIA)是近年來出現的一種較為穩定、準確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法[1-3]。是在高分子膠乳微球的表面交聯抗體或抗原，當交聯有抗體或抗原的微球與抗原或抗體結合后，在短時間內會迅速聚集在一起，改變了反應液的散光性能或透光性能。而且，反應液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原或抗體的濃度有較強的相關性,在一定范圍內可以反映被測物的濃度。PETIA法操作步驟的簡化也相應地避免了許多人為操作因素和試劑、環境等外界因素的干擾，穩定性和重復性都較好，能較真實地反映被測物質的含量，從而能更好地幫助醫生正確地診斷過敏原，并判定該過敏原的致敏反應程度。目前國外關于食物過敏原診斷試劑盒都生產企業主要有瑞典Pharmacia Diagnostis、英國GENESIS、美國BIOMERICA和德國MEDIWISS等公司，而國內主要是杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司等公司。這些診斷試劑公司的食物過敏原診斷試劑盒都主要采用ELISA方法[3-12]。

該方法的標準曲線Y=837.1x2-125.2x+10.036，線性范圍：0～400 U/ml，相關系數為0.996，本實驗建立的蟹食物蛋白PETIA檢測法，具有靈敏、特異、操作簡單、快速、穩定且易自動化操作等優點，能夠滿足臨床應用的要求：在表1我們看出，經4℃/7 d，37℃/30 d與半年時間檢測，所得檢測數據與曲線沒有明顯差異及偏移；方法靈敏，最低檢測限(LoD)為19.600 U/ml。線性范圍較寬：0～40 U/ml，相關系數為0.996，批內以及批間的變異系數均低于10%；在臨床應用上，第一，我們獲得參考范圍95%可信區間為<33.5 U/ml。將血清中蟹IgG水平大于33.5 U/ml的患者認定為蟹食物過敏原陽性；第二，該方法的敏感度89.61%，特異性65.22%，準確度84.00%，陽性預示值89.61%，陰性預示值65.22%,甘油三酯濃度在5.00 mmol/L以下，血紅蛋白濃度在5 g/L以下對蟹IgG檢測濃度影響不大，ROC的曲線下面積(AUC)為0.957。第三，收集的100份患者血清，進行PETIA與ELISA法進行結果比對，顯示回歸方程為Y=1.264x+27.599(Y為ELISA法結果，x為PETIA法結果)，相關系數為0.890 2，兩者具有良好的相關性，由該結果可見我們新創的膠乳免疫增強比濁法可用于臨床血清標本中蟹食物蛋白過敏原的檢測，從而預示患者過敏狀態的發生發展。所以我們建立的蟹食物蛋白過敏原膠乳免疫增強比濁法，符合2010版《中國藥典》中有關體外診斷試劑的應用要求[13]。但也存在很多不足，如，我們改進了實驗方法，但在檢測范圍上與其他檢測方法相比并未改進；其次在臨床評價上選取的標本例數100例，還需進一步檢測，來提高方法的陰性預測值、陽性預測值以及方法的靈敏度與特異性。

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[收稿2015-07-16修回2015-11-25]

(編輯張曉舟)

Development and application of Latex enhanced immune turbidimetry for food allergen

LULing-Ling,ZHENGGuo-Jun,TUFei-Pei,WUHai-Ou,LIUXiao-Qiong.

RuianHospitalofTraditionalChineseMedicine,Ruian325200，China

[Abstract]Objective:To establish a method to detect food allergen based on Latex-enhanced immune turbidimetry (PETIA) and apply to clinic.Methods: The PETIA method was used for evaluating the detection system including standard curve, detection-limit,stability, intra-assay and inter-assay precision and cross-reactivity,clinical normal serum specimens and clinical allergic diseases serum specimens were measured to evaluated the perspective of the clinical application.Results: The standard curve :Y=837.1x2-125.2x+10.036, linear range: 0.0-400 U/ml,the correlation coefficient of the standard curve was 0.996,the intrabatch and interbatch precision was<10%.The normal reference range was≤33.5 U/ml,the AUC of ROC curve was 0.957,the sensitivity was 89.61%,The specificity was 65.22%，the accuracy was 84.00%, and the positive predicted value was 89.61%,the negative predicted value was 65.22%.the test results have strong correlation with ELISA (r=0.890 2).Conclusion: The PETIA method for detecting food allergen achieved corresponding clinical application standards and may be used for the diagnosis of food allergies.

[Key words]Latex;Immunonephelometry;Methodology;Allergen

中圖分類號R383.2

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0377-05

作者簡介：盧玲玲(1984年-)，女，碩士，主管檢驗師，主要從事臨床診斷學研究。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.018

①本文為瑞安市科技局項目(No.MS2015042)。

②瑞安市人民醫院檢驗科，瑞安325200。