嬰幼兒重癥和非重癥肺炎淋巴細胞亞群的差異分析①

龍思琪　馬　莉　陳　敏　李　虹

(貴州醫科大學附屬醫院中心實驗室，貴陽550004)

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嬰幼兒重癥和非重癥肺炎淋巴細胞亞群的差異分析①

龍思琪馬莉陳敏②李虹

(貴州醫科大學附屬醫院中心實驗室，貴陽550004)

[摘要]目的：觀察重癥肺炎和非重癥肺炎患兒淋巴細胞亞群水平，探討患兒的細胞免疫功能變化并為臨床治療提供參考。方法：收集重癥肺炎患兒27例、非重癥肺炎(普通肺炎)患兒28例以及20例健康對照，采用流式細胞術檢測研究對象外周血中CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD16+CD56+NK細胞的水平，并進行比較分析。結果：重癥肺炎組CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴細胞及NK細胞比例明顯低于健康對照(P<0.01，P<0.05，P<0.01，P<0.05)，而CD4/CD8比值、CD19+B淋巴細胞比例則顯著高于健康對照組(P<0.05，P<0.01)；非重癥肺炎組CD3+CD8+T淋巴細胞低于健康對照(P<0.01)，而CD19+B淋巴細胞比例則顯著高于健康對照組(P<0.01)；與非重癥肺炎組相比，重癥肺炎組CD3+T、CD3+CD8+T淋巴細胞比例顯著降低(P<0.01)，而CD19+B淋巴細胞比例則明顯升高(P<0.01)。結論：重癥與非重癥肺炎患兒機體存在明顯的細胞免疫功能紊亂，重癥肺炎患兒的細胞免疫功能受損更為嚴重，為臨床評估病情及免疫治療提供一定的理論依據。

[關鍵詞]重癥肺炎；T淋巴細胞亞群；CD19+B淋巴細胞；細胞免疫功能

肺炎是兒科的常見病，重癥肺炎或可由于肺炎治療不及時而導致，占肺炎7%～13%[1]，其起病快、并發癥多、常累及全身，是引起嬰幼兒死亡的主要原因[2]。嬰幼兒免疫系統尚未發育完全，監測淋巴細胞亞群變化，可反映嬰幼兒體內細胞免疫功能狀態。本文旨在探討重癥與非重癥肺炎患兒的免疫功能變化，為臨床評估病情嚴重程度變化及指導治療提供參考價值。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1倫理聲明本研究符合《赫爾辛基宣言》，并通過貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準并出示證明。所有研究對象家長均知情同意。

1.1.2一般資料選擇2014年4月至2015年6月的貴陽市兒童醫院收治重癥肺炎患兒27例，其臨床診斷符合2005年中華醫學會兒科學分會《2005年全國小兒社區獲得性呼吸道感染專題研討會紀要》、《醫院獲得性肺炎診斷和治療指南》中重癥肺炎診斷標準[3]，其中男21例，女6例；年齡1～36月；同時入選同期住院治療的28例非重癥肺炎患兒，其中男24例，女4例；年齡1～48月。重癥肺炎組與非重癥肺炎組均排除近兩周使用免疫調節藥物及其他先天性免疫缺陷疾病史，且均無心、腦及肝腎等重要器官疾病。另選同期兒保門診經體檢為健康正常小兒20例為健康對照組，三組性別、年齡資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標本采集抽取1～2 ml空腹靜脈血，EDTA抗凝，顛倒混勻。

1.2.2主要儀器與試劑FACS-Canto II(美國BD公司)；六色TBNK檢測試劑盒(美國BD公司)[Percp-cy5.5-CD45、FITC-CD3、Apc-cy7-CD4、Pe-cy7-CD8、Pe-CD16+56、Apc-CD19]；溶血素(美國BD公司)；PBS(磷酸鹽緩沖液)。

1.2.3流式細胞術檢測取100 μl新鮮抗凝全血，加入含20 μl抗體的BD上樣管中，震蕩混勻，室溫避光孵育15 min，加入800 μl 1×的免洗溶血素溶血，樣本溶血充分后待上機。運行FACSDIVA軟件，調節電壓和熒光補償在最佳狀態，上樣并分析。

2結果

2.1三組研究對象T淋巴細胞亞群水平應用流式細胞術檢測了對照組(Health comparison，HC組)、非重癥肺炎組(Non-severe pneumonia，NSP組)和重癥肺炎組(Severe pneumonia，SP組)的淋巴細胞各亞群(見圖1)。SP組CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T顯著低于HC組(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，而CD4/CD8比值明顯高于HC組(P<0.05)，見表1和圖2A～D。與NSP組相比，SP組CD3+T、CD3+CD8+T細胞比例顯著下降(P<0.01)，見表1和圖2A、C。NSP組CD3+T、CD3+CD4+T細胞水平低于HC組，差異無統計學意義(P>0.05)，但NSP組CD3+CD8+T細胞水平明顯低于HC組(P<0.01)，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1和圖2A～C。

圖1　流式細胞術檢測重癥肺炎、非重癥肺炎及健康對照組外周血中CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD16+56+NK 細胞Fig.1　Flow cytometry analysis of frequency of peripheral blood CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T,CD19+B,CD16+56+NK cells in HC,NSP and SP groups

GroupsnCD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD19+BNKCD4/CD8HCgroup2070.18±4.3040.66±4.5330.40±3.3610.14±2.4210.32±2.311.49±0.31NSPgroup2864.41±8.9636.43±8.8924.26±6.391)25.31±8.771)7.04±6.481.72±0.90SPgroup2752.14±15.511)3)31.52±13.532)18.20±6.691)3)35.94±16.541)3)6.54±6.742)2.06±1.232)

Note：Compared with HC，1)P<0.01，2)P<0.05；compared with NSP，3)P<0.01.

圖2　HC、NSP和SP組CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD16+56+NK細胞及CD4/CD8比值的比較Fig.2　Comparison of percentage of CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T,CD19+B,CD16+56+NK cells and CD4/CD8 among HC,NSP and SP groupsNote: A.The comparison of the percentage of CD3+T cells;B.The comparison of the percentage of CD3+CD4+T cells;C.The comparison of the percentage of CD3+CD8+T cells;D.The comparison of CD4/CD8;E.The comparison of the percentage of CD19+B cells;F.The comparison of the percentage of CD16+56+NK cells.

2.2三組研究對象CD19+B、NK細胞的水平NSP和SP組CD19+B細胞水平顯著高于HC組(P<0.01)，且SP組明顯高于NSP組(P<0.01)，見表1和圖2E。SP組與NSP組比較NK細胞水平差異無統計學意義(P>0.05)，但與HC組相比，SP組NK細胞水平顯著降低(P<0.05)，見表1和圖2F。

3討論

目前研究指出，嬰幼兒肺炎的發病機制不僅與病原體直接侵害有關，與機體免疫功能尚有密切聯系，嬰幼兒的免疫系統發育不完善，抵御外界致病原入侵的能力較弱，這為外界病原菌如支原體、病毒、細菌的直接入侵創造了有利條件，入侵的病原菌可進一步破壞患者體內的T淋巴細胞平衡[4]，損害機體免疫功能。人體外周血中淋巴細胞亞群主要包括了T淋巴細胞、B淋巴細胞及NK細胞，它們相互協調、制約，共同維持機體免疫穩態，一旦機體受到外界病原菌感染導致免疫系統失調時，各淋巴細胞亞群的數量及功能均會發生異常，以致免疫功能降低從而引起疾病的發生與發展。T淋巴細胞是反映機體免疫功能的重要指標，具有多種生物學功能，如直接殺傷靶細胞、輔助B細胞體液免疫及分泌細胞因子間接作用于靶細胞，維持機體免疫平衡的重要意義。CD3+T淋巴細胞代表了所有的成熟T細胞及機體細胞免疫的基礎，根據表面CD分子表達不同分為CD3+CD4+T和CD3+CD8+T淋巴細胞，CD3+CD4+T細胞為輔助性T細胞，可通過釋放多種因子激活B細胞和效應T細胞來上調機體的免疫功能[5,6]，CD4+T淋巴細胞的減少會使人體逐漸喪失對抗原的免疫反應。有學者指出，CD4+T淋巴細胞肺內發揮尤其重要的功能。研究報道，在感染的肺組織中，CD4+T淋巴細胞可提高吞噬細胞活性，加強B細胞反應，并促進CD8+T淋巴細胞擴增，對保持CD8+T淋巴細胞監控和殺傷功能有重要作用[7]。而CD3+CD8+T細胞即為抑制性/細胞毒性T淋巴細胞具有抑制機體免疫應答或細胞毒的功能[8]。正常情況下，CD4+T細胞與CD8+T細胞相互制約，以產生適度的免疫應答，使之既能清除異物又不致損傷機體自身組織，處于動態平衡的狀態，以維持機體免疫功能的穩定[9]。本研究結果顯示，無論是重癥肺炎還是非重癥肺炎患兒體內的CD3+T、CD3+CD4+T淋巴細胞水平均出現了不同程度的降低，這與國內學者研究結果趨勢一致[10,11]。與健康對照組比較，重癥肺炎組CD3+T、CD3+CD4+T及CD3+CD8+T下降顯著(P<0.01、P<0.05、P<0.01)，以CD3+CD8+T細胞減少尤為突出，三組間相互比較均有顯著差異(P<0.01)。重癥肺炎患兒CD3+T、 CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細胞顯著下降說明機體T淋巴細胞的功能有整體受到抑制的可能，CD4+輔助性T細胞促進細胞免疫及體液免疫的作用減弱，尤其CD8+抑制性T細胞的抑制免疫細胞的增殖與分化的功能亦被削弱得更加明顯。與重癥肺炎不同的是，非重癥肺炎與健康對照組比較CD3+T、 CD3+CD4+T減少并不明顯，而CD3+CD8+T細胞比例已顯著下降，提示非重癥肺炎患兒T細胞的抑制和細胞毒功能已有明顯減弱的可能，從而造成機體未能及時有效地清除帶有致病原的細胞，給致病原的傳播創造了有利條件，間接引起病情惡化。

本次研究觀察到重癥肺炎組CD4/CD8比值較健康對照顯著升高，這與Zhu等[12]的研究結果不同，Zhu等研究指出支氣管肺炎患兒的CD4/CD8比值與對照組比較差異無統計學意義，分析之所以結果出現差異與兩次研究患兒入選組別標準不盡相同有關，本研究患兒的分組依據按照2005年中華醫學會兒科學分會《2005年全國小兒社區獲得性呼吸道感染專題研討會紀要》、《醫院獲得性肺炎診斷和治療指南》中的診斷標準[3]，而Zhu等患兒分組依據按WHO肺炎及重癥肺炎的診斷標準[13]，這可能引起兩次研究入選同一組別的患兒病情程度卻不一致，從而出現不同研究結果。

本研究結果發現肺炎組與重癥肺炎組較對照組CD19+B淋巴細胞比例均顯著上升，且重癥肺炎組顯著高于肺炎組。提示患兒有B淋巴細胞活化，產生抗體的能力增強，介導體液免疫抵御外界病原菌的可能。但由于大多數B淋巴細胞在抗原刺激后，需在CD4+T細胞的輔助下，產生抗體，發揮體液免疫的作用，本組資料顯示重癥肺炎組CD4+T輔助性細胞明顯減少，顯然存在不能給B淋巴細胞提供足夠的輔助功能的可能性，再加上嬰幼兒免疫系統尚未發育完善，呼吸道局部免疫功能不足，肺泡巨噬細胞殺菌和吞噬能力低下，嬰幼兒呼吸道分泌的溶菌酶、乳鐵蛋白、補體、干擾素等與抵抗病原微生物的物質含量低，且B淋巴細胞也未完全成熟，機體有時并不能產生特異性抗體[14]。所以雖然重癥肺炎組患兒B淋巴細胞比例上升，但生成抗體及發揮體液免疫功能并不一定增強。

NK細胞稱為自然殺傷細胞，是機體固有免疫的一部分，可直接殺傷病原體或被感染靶細胞，也可通過分泌γ干擾素(IFN-γ)來調節機體的免疫功能，促進Th1型免疫反應[15]。本研究結果中重癥及非重癥肺炎組NK細胞水平較健康對照組均下降，但唯有重癥肺炎組與健康對照組NK細胞水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，這提示重癥肺炎患兒NK細胞免疫功能有受損更為嚴重的可能。

綜上所述，重癥肺炎及非重癥肺炎患兒的免疫功能都受到了不同程度損害。CD19+B細胞比例與疾病嚴重程度呈負相關的趨勢，而CD3+CD8+T細胞比例與疾病嚴重程度呈正相關趨勢，CD3+CD8+T、CD19+B淋巴細胞水平能否成為臨床判斷疾病嚴重程度參考指標，尚有待進一步研究。同時，本次研究提示重癥肺炎患兒細胞免疫功能存在受損更為嚴重的可能性，其T細胞總數及各亞群水平均顯著下降，識別和殺傷致病菌能力被削弱，有利于致病菌進一步擴散繁衍而加重疾病進展，這提示在臨床治療方面，除了應用相應抗生素進行治療，也要注重的應用免疫調節劑，可能對防止并發癥、提高療效、縮短病程有重要意義。同時我們也注意到本次研究存在樣本量較少和未能涉及CD19+B細胞亞群檢測的局限性，需要未來更多的研究去填補這一局限。

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[收稿2015-06-03修回2015-07-23]

(編輯張曉舟)

Analysis difference of lymphocyte subgroups between children with severe pneumonia and non-severe pneumonia

LONGSi-Qi,MALi,CHENMin,LIHong.

CentralLaboratory,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China

[Abstract]Objective:To observe the levels of lymphocyte subgroups in children with severe pneumonia and non-severe pneumonia,and to investigate the change of celluer immune funciton of patients,moreover provide available reference for treatment.Methods: Flow cytometry instrument was used to detect peripheral blood CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T,CD19+B lymphocytes and NK cells in 27 children with severe pneumonia and 28 children with non-severe pneumonia.In addition 20 heathy children were selected as the controls.Results: Compared with the heathy control group,the levels of CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T lymphocytes and NK cells in children with severe pneumonia decreased significantly(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.05),while CD4/CD8 ratio,CD19+B cells were significantly increased(P<0.05,P<0.01).The level of CD3+CD8+T lymphocytes in children with non-severe pneumonia significantly lower than the heathy control group(P<0.01),but the level of CD19+B cells in children with non-severe pneumonia significantly higher than the heathy control group(P<0.01).Compared with non-severe pneumonia group.The levels of CD3+and CD3+CD8+T lymphocytes in children with severe pneumonia decreased significantly(P<0.01),however CD19+B cells were significantly increased(P<0.01).Conclusion: Immune dysfunction exists in both of children with severe pneumonia and non-severe pneumonia.Children with severe pneumonia has more serious damage in inmmunity.This provides certain theoretical basis for clinical evaluation and treatment.

[Key words]Severe pneumonia；T lymphocytes subsets；CD19+B lymphocytes ；Cellur immunity

中圖分類號R563.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0401-04

作者簡介：龍思琪(1988年-)，女，在讀碩士，檢驗技師，主要從事兒童免疫功能缺陷及流式細胞術臨床應用的研究，E-mail:longsiqi330@163.com。通訊作者及指導教師：馬莉(1962年-)，女，教授，主任技師，碩士生導師，主要從事兒童免疫功能缺陷及自身免疫性疾病的研究，E-mail:18608505639@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.023

①本文為貴州省衛生廳科學技術基金項目(No.gzwkj2013-1-016)。

②貴州省貴陽市兒童醫院，貴陽550004。