CD163分子在非小細胞肺癌患者組織中表達及其對肺癌細胞侵襲和增殖的影響

黃冬云　許文景　周　銳　徐興祥　張旭東

(蘇北人民醫院老年科，揚州225001)

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CD163分子在非小細胞肺癌患者組織中表達及其對肺癌細胞侵襲和增殖的影響

黃冬云許文景①周銳徐興祥張旭東

(蘇北人民醫院老年科，揚州225001)

[摘要]目的：探討非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)患者血漿和肺癌組織中CD163分子表達水平以及對肺癌細胞侵襲和增殖的影響。方法：選取我院35例NSCLC患者為研究組，35例同期體檢的健康人群為對照組，采用Real-time RCR檢測肺癌患者腫瘤組織和血漿中CD163表達水平；采用小分子干擾RNA(siRNA)抑制MH-2中CD163分子的表達，再與A549共培養，transwell法觀察CD163分子對A549侵襲的影響，CCK-8法檢測A549增殖的變化。結果：CD163分子在NSCLC患者血漿中的表達水平顯著高于正常健康人群，差異具有統計學意義(P<0.05)，在腫瘤組織中的表達顯著高于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.05)；轉染后，A549的侵襲和增殖能力顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論：CD163在NSCLC患者血漿和肺癌組織中高表達，并可增強肺癌細胞的侵襲和增殖能力。

[關鍵詞]CD163；NSCLC；侵襲；增殖

肺癌是目前世界范圍內致死率最高的腫瘤，是最常見的惡性腫瘤之一，預后較差[1]。其中80%是非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]，研究發現，NSCLC患者的5年生存率僅為15%，并且復發率很高[3]。目前肺癌的治療仍以手術切除為主，輔以放療和化療。近年來研究證實肺癌組織中的巨噬細胞參與腫瘤的發生、發展和轉移[4,5]，此類巨噬細胞被稱為腫瘤相關性巨噬細胞(Tumor associated macrophages，TAMs)[6]。CD163分子位于單核巨噬細胞上，富含半胱氨酸重復序列，屬于清道夫受體家族[7]。研究表明在乳腺癌、直腸癌和平滑肌肉瘤中CD163高表達巨噬細胞浸潤密度與生存期密切相關，是疾病進展、早期復發和轉移的預測因子[8]。但CD163分子在NSCLC的發病機制中的作用尚存在一定爭議，本文旨在研究CD163分子在NSCLC患者腫瘤組織和血漿中的表達，以及干擾肺癌細胞中CD163分子表達后，對肺癌細胞侵襲及增殖能力的影響，從而對于肺細胞癌的防治和預后的預測提供一定的理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料選取2014年3月至2015年3月期間，本科室NSCLC手術患者35例為研究組，其中男21例，女14例，年齡24～75歲，平均年齡(49.7±5.4)歲。所有患者術前均未經介入或放化療等治療，均接受了肺癌根治性切除術，所有患者術后病理學證實為非小細胞肺癌，且未發現遠處轉移，排除合并其他慢性病如高血壓、糖尿病或其他腫瘤等的患者。同期健康體檢人群35例為對照組，其中男23例，女12例，年齡32～73歲，平均年齡(53.6±50)歲。留取肺癌患者和正常健康組外周血2 ml，靜置6 h后，離心取上清；于腫瘤組織術中離體30 min內留取肺癌組織及對應癌旁組織，待測。

1.1.2主要試劑肺癌細胞株A549、肺泡巨噬細胞MH-S購自ATCC公司；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；熒光標記的2′-O-甲基siRNA CD163-FAM、穩定陰性對照siRNA CD163-NC和CD163、GAPDH引物購自上海吉瑪生物技術有限公司；RNA提取試劑盒Trizol購于Gibco公司；Real-time PCR試劑盒購自ROCHE公司；抗CD163抗體購自abcam公司；抗β-actin抗體購自SantaCruz公司；羊抗兔二抗購自SantaCruz公司；CCK-8購自上海博谷生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養肺癌細胞株A549、肺泡巨噬細胞MH-S在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，至對數生長期，以1×105個細胞/平皿接種于25 ml培養瓶平皿，置于37℃、5%CO2、95%濕度培養箱，孵育細胞。

1.2.2細胞轉染采用脂質體2000(美國Invitrogen公司)對肺泡巨噬細胞MH-S1中CD163 mRNA抑制表達，并以PBS、siRNA CD163-NC作為對照，于48 h后檢測其干擾效率。

1.2.3檢測指標Real-time PCR檢測CD163 mRNA表達水平：將留取的肺癌患者及對照血漿、腫瘤組織和轉染后MH-S，依照產品說明書，以GAPDH作為內參，Real-time PCR檢測CD163分子的表達水平。CD163引物：正向5′-TGGACTGTGGCGT-GGCTATT-3′，反向5′-TTGGAGACATATTGCTGC-TGCC-3′。 PCR使用ABI公司的7900型號Real-time PCR儀器，結果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

Western blot檢測轉染后MH-S中CD163分子蛋白表達水平：肺癌細胞培養至對數生長期，按照蛋白抽提步驟，提取總蛋白；采用BCA法測定總蛋白濃度，經SDS-PAGE 電泳后轉移到NC膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST 洗滌后，分別加入1∶1 000抗CD163抗體、1∶500抗β-actin抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入1∶5 000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h ，再用TBST 洗滌，化學發光并曝光成像。Weastern blot檢測以β-actin條帶作為內參，CD163分子條帶與其比較，觀察CD163分子蛋白表達變化。

細胞遷移實驗：將處于對數生長期的A549和MH-S 2種細胞株，按照10∶1的比例，調整細胞密度至4×105個/ml，按0.1 ml/孔加入到24孔板懸掛式transwell(millipore公司)小室的上層，小室下層加入1 ml的含有10%血清的培養液。培養24 h后，對己遷移至小室下層的A549細胞進行計數(隨機選取5個視野)。

細胞增殖實驗：將處于對數生長期的A549和MH-S 細胞株按10∶1的比例，以50%的匯合率接種至96孔板，每組設置3個復孔，同時設置只含MH-S和不含細胞的空白培養基作為對照，37℃、5%CO2、95%濕度下培養24 h后，分別在培養孔加入10 μl CCK-8溶液；孵育2 h，美國biotek酶標儀(Elx800)檢測450nm的吸光值，每孔實測OD值需減去空白對照OD值，取三復孔平均值，記錄OD值。

2結果

2.1肺癌患者血漿中CD163 mRNA的表達水平CD163 mRNA在肺癌患者血漿中表達顯著高于正常健康人群(表1)，具有統計學意義(t=16.15，P<0.001)，提示了肺癌患者血漿中CD163 mRNA的高表達水平，可能與肺癌的發病密切相關。

2.2肺癌患者組織中CD163 mRNA的表達水平CD163 mRNA在肺癌患者腫瘤組織中表達顯著高于對應的癌旁組織(表2)，具有統計學意義 (t=14.53，P<0.001)， 提示了肺癌患者腫瘤組織中CD163 mRNA的高表達水平，可能與肺癌的發生發展和預后轉歸密切相關。

表1肺癌患者血漿中CD163 mRNA表達水平

Tab.1CD163 mRNA expression level in plasma of patients with lung cancer

GroupsCase(n)CD163mRNAlevelt/PvalueLungcancergroup3512.78±1.89Normalgroup356.89±1.0416.153/0.0001)

Note：Compared with normal group,1)t=16.15，P<0.001.

表2肺癌患者組織中CD163 mRNA表達水平

Tab.2CD163 mRNA expression level in tissue of patients with lung cancer

GroupsnCD163mRNAlevelt/PvalueTumortissue3523.59±2.56Tumoradjacenttissue3516.33±1.4814.534/0.0001)

Note：Comparison with adjacent tissues,1)t=14.53，P<0.001.

圖1　轉染siRNA CD163后MH-S中CD163分子表達變化Fig.1　Expression of CD163 in MH-S after transfection with CD163 siRNANote: A.CD163 mRNA expression changes in MH-S；B.CD163 protein expression changes in MH-S，*.P<0.001.

2.3肺泡巨噬細胞轉染后CD163分子表達水平變化各組CD163分子表達水平如下：PBS組：1.12±0.17，對照組(siRNA-NC)：0.96±0.16，肺泡巨噬細胞MH-S轉染siRNA組(siRNA-FAM)：0.09±0.02。 經單因素方差分析，F=549.521，P=0.000； 兩兩比較顯示：肺泡巨噬細胞MH-S轉染siRNA CD163后，同對照組相比，CD163 mRNA的表達水平明顯下降，LSD-t=25.846，P=0.000(圖1A)差異具有統計學意義；CD163分子蛋白表達水平也明顯降低(圖1B)，提示低表達CD163分子肺泡巨噬細胞構建成功。

2.4肺泡巨噬細胞中CD163對細胞侵襲的影響各組CD163分子對細胞侵襲的影響資料(Cell Count,×104)分別為：PBS組：45.2±3.7，對照組(siRNA-NC)：42.7±3.8，肺泡巨噬細胞MH-S轉染siRNA組(siRNA-FAM)：12.5±3.2。 經單因素方差分析，F=776.022，P=0.000； 兩兩比較顯示：肺泡巨噬細胞MH-2轉染siRNA CD163后，同對照組相比，transwell小室下層肺癌細胞A549數量顯著減少。LSD-t=33.003，P=0.000，差異具有統計學意義，提示了CD163分子具有增強肺癌細胞侵襲的能力。見圖2。

圖2　MH-2中CD163分子對細胞侵襲功能的影響Fig.2　Effect of CD163 on cell invasion in MH-2Note: *.P<0.001.

圖3　MH-2中CD163分子對細胞增殖功能的影響Fig.3　Effect of CD163 on cell proliferation in MH-2Note: *.P<0.001.

2.5肺泡巨噬細胞中CD163對細胞增殖能力的影響各組CD163分子對肺癌細胞增殖能力的影響OD值分別為：PBS組：3.03±0.22，對照組(siRNA-NC)：2.87±0.25，肺泡巨噬細胞MH-2轉染siRNA組(siRNA-FAM)：1.43±0.10。 經單因素方差分析，F=701.120，P=0.000；兩兩比較顯示：肺泡巨噬細胞MH-S轉染siRNA CD163后，同對照組相比，肺癌細胞A549增殖顯著減少。LSD-t= 30.277，P=0.000，差異具有統計學意義，提示了CD163分子具有增強肺癌細胞增殖的能力。見圖3。

3討論

肺癌是目前為止世界范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。全世界每年新發肺癌病例數為180多萬，占所有惡性腫瘤新發病例的13%，每年肺癌導致的死亡患者近160萬，占所有惡性腫瘤死亡人數的19.4%[9]。在我國，肺癌的發病率和死亡率一直居于所有腫瘤的首位，據統計，2010年我國肺癌發病率占所有惡性腫瘤的19.59%，死亡率占所有惡性腫瘤的24.89%[10]，而且多數肺癌患者就診時已經是晚期。巨噬細胞是一個異質性的群體，在不同的環境下表現為不同的功能。在腫瘤的發病過程中，腫瘤組織中有大量的巨噬細胞浸潤，這種細胞被稱之為腫瘤相關性巨噬細胞(Tumor associated macrophages，TAMs)[11]。但是對于TAM在腫瘤發病中的作用，尚存在不同觀點。有學者研究發現，在胃癌、結腸癌等腫瘤中TAM高表達[12，13]，患者生存率高，預后好，TAM具有抑制腫瘤細胞的作用；而另外一些動物實驗和臨床研究指出甲狀腺癌、肝癌、黑色素瘤等腫瘤中TAM高表達[14-16]，患者生存率低，死亡率高、預后差。CD163分子是富含半胱氨酸清道夫受體超家族一員，特異性地表達在單核巨噬細胞表面，經腫瘤壞死因子α轉換酶(ADAM17)切割致其胞外段脫落，為可溶性CD163，進入患者血液循環系統；通過與腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑(TWEAK)結合，參與腫瘤細胞的增殖或凋亡[17]。

本研究發現肺癌患者血漿中CD163分子的表達顯著高于同期健康人群；此外，肺癌患者腫瘤組織中的CD163分子的表達顯著高于相對應的癌旁組織，結果均提示CD163分子在肺癌患者血漿和腫瘤組織中表達水平的變化可能是調控肺癌細胞中的信號途徑，參與肺癌的發生發展和轉歸關系密切。Tiainen等[18]研究研究發現乳腺癌患者體內M2樣巨噬細胞浸潤增加，高表達CD163分子，導致透明質酸的累積，與乳腺癌的發病和預后密切相關，這些結果從側面支持了本研究。腫瘤細胞的侵襲和增殖能力與腫瘤的轉移和生長速度密切相關，影響著腫瘤的發展和轉歸。本研究通過細胞轉染技術，成功構建了CD163分子低表達的肺泡巨噬細胞MH-S細胞株，將肺巨噬細胞MH-S和肺癌細胞A549共培養，通過transwell實驗發現，與正常表達CD163分子MH-S共培養的A549細胞的侵襲能力顯著強于與低表達CD163分子MH-2共培養的A549細胞，說明CD163分子表達水平的高低影響著肺癌細胞的侵襲能力。此外，本研究運用CCK-8實驗研究肺癌細胞增殖能力發現，與正常表達CD163分子MH-S共培養的A549細胞的增殖能力顯著強于與低表達CD163分子MH-S共培養的A549細胞，說明CD163分子表達水平越高，肺癌細胞的增殖能力越強。CD163分子的表達水平影響肺癌細胞的侵襲和增殖能力。這與Yang等[19]的在肺癌患者惡性腫瘤胸腔積液中的研究結果是一致的。

綜上所述，在肺癌患者血漿和腫瘤組織中CD163分子的表達水平顯著升高，而且CD163分子可能增強肺癌細胞的侵襲和增殖能力，從而使肺癌生長速度加快，侵襲能力增強，這為肺癌診斷治療和預測預后提供了理論參考依據。

參考文獻：

[1] Meng J,Xie W,Cao L,etal.shRNA targeting HDGF suppressed cell growth and invasion of squamous cell lung cancer[J].Acta biochimica et biophysica Sinica,2010,42(1):52-57.

[2] Jemal A,Siegel R,Ward E,etal.Cancer statistics,2009[J].CA,59(4):225-249.

[3] Miller YE.Pathogenesis of lung cancer:100 year report[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2005,33(3):216-223.

[4] Qian BZ,Pollard JW.Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis[J].Cell,2010,141(1):39-51.

[5] Buddingh EP,Kuijjer ML,Duim RA,etal.Tumor-infiltrating macrophages are associated with metastasis suppression in high-grade osteosarcoma:a rationale for treatment with macrophage activating agents[J].Clin Cancer Res,2011,17(8):2110-2119.

[6] Omatsu M,Kunimura T,Mikogami T,etal.Difference in distribution profiles between CD163+tumor-associated macrophages and S100+dendritic cells in thymic epithelial tumors[J].Diagnostic Pathol,2014,9(1):215.

[7] Ma J,Liu L,Che G,etal.The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time[J].BMC Cancer,2010,10:112.

[8] Mansfield AS,Heikkila P,von Smitten K,etal.The presence of sinusoidal CD163(+) macrophages in lymph nodes is associated with favorable nodal status in patients with breast cancer[J].Virchows Archiv,2012,461(6):639-646.

[9] Genestreti G,Di Battista M,Cavallo G,etal.Maintenance therapy in non-small cell lung cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther,2015:1-8.

[10]Chen W,Zheng R,Zhang S,etal.Annual report on status of cancer in China,2010[J].Chin J Cancer Res,2014,26(1):48-58.

[11]Thanee M,Loilome W,Techasen A,etal.Quantitative changes in tumor-associated M2 macrophages characterize cholangiocarci-noma and their association with metastasis[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(7):3043-3050.

[12]Lin CN,Wang CJ,Chao YJ,etal.The significance of the co-existence of osteopontin and tumor-associated macrophages in gastric cancer progression[J].BMC Cancer,2015,15:128.

[13]Leimgruber A,Berger C,Cortez-Retamozo V,etal.Behavior of endogenous tumor-associated macrophages assessed in vivo using a functionalized nanoparticle[J].Neoplasia,2009,11(5):459-468,452 p following 468.

[14]Fang W,Ye L,Shen L,etal.Tumor-associated macrophages promote the metastatic potential of thyroid papillary cancer by releasing CXCL8[J].Carcinogenesis,2014,35(8):1780-1787.

[15]Ortega RA,Barham WJ,Kumar B,etal.Biocompatible mannosylated endosomal-escape nanoparticles enhance selective delivery of short nucleotide sequences to tumor associated macrophages[J].Nanoscale,2015,7(2):500-510.

[16]Wang T,Xiao M,Ge Y,etal.BRAF Inhibition Stimulates Melanoma-Associated Macrophages to Drive Tumor Growth[J].Clin Cancer Res,2015,21(7):1652-1664.

[17]Fabriek BO,van Bruggen R,Deng DM,etal.The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria[J].Blood,2009,113(4):887-892.

[18]Tiainen S,Tumelius R,Rilla K,etal.High numbers of macrophages,especially M2-like (CD163-positive),correlate with hyaluronan accumulation and poor outcome in breast cancer[J].Histopathology,2015,66(6):873-883.

[19]Yang L,Wang F,Wang L,etal.CD163+tumor-associated macrophage is a prognostic biomarker and is associated with therapeutic effect on malignant pleural effusion of lung cancer patients[J].Oncotarget,2015,6(12):10592-10603.

[收稿2015-07-25]

(編輯張曉舟)

Expression of CD163 in patients of non-small cell lung and effects of cancer cell migration and proliferation

HUANGDong-Yun，XUWen-Jing，ZHOURui，XUXing-Xiang，ZHANGXu-Dong.

DepartmentofGerliatricMedicine,NorthernJiangsuPeople′sHospital,Yangzhou225001,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of CD163 in the plasma and tumor tissue of non-small cell lung cancer(NSCLC)patients,and the effects of cancer cell migration and proliferation.Methods: 35 cases of NSCLC patients in our hospital as the study group,and 35 healthy volunteers as control group,we used Real-time RCR to detect the expression of CD163 in the plasma and tumor tissue of NSCLC patients.Using small interfering RNA (siRNA) to inhibit the expression of CD163 in MH-2,and co-culture with A549.The level of cancer cell migration was observed by transwell and the level of cell proliferation was observed by CCK-8.Results: The expression of CD163 in the plasma and tumor tissue of NSCLC patients was significantly higher than the control group,the difference was statistically significant (P<0.05);after the expression of CD163 was suppressed in MH-2,the levels of cancer cell migration and proliferation were significantly decreased,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion: The expression of CD163 in the plasma and tumor tissue of NSCLC patients is increased,and may elevate the levels of cancer cell migration and proliferation.

[Key words]CD163;NSCLC;Migration;Proliferation

中圖分類號R734.2

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0410-05

作者簡介：黃冬云(1980年-)，女，碩士，主治醫師，主要從事肺癌診斷及治療方面的研究。

通訊作者①。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.025