葡萄糖-6-磷酸異構酶混合肽段誘導的DBA/1小鼠類風濕性關節炎模型的建立*

張雪嬌，　劉嘉琳,2，　楊　飛，　婁永富，　王　強，　陳冬志，　孟　明△

(1河北大學醫學部，河北 保定 071000; 2中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

?

葡萄糖-6-磷酸異構酶混合肽段誘導的DBA/1小鼠類風濕性關節炎模型的建立*

張雪嬌1，劉嘉琳1,2，楊飛1，婁永富1，王強1，陳冬志1，孟明1△

(1河北大學醫學部，河北 保定 071000;2中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

[摘要]目的： 利用葡萄糖-6-磷酸異構酶(GPI)單一肽段及混合多肽片段免疫DBA/1小鼠，建立類風濕性關節炎(RA)模型，分析其主要評價指標及特點，為探討RA的免疫機制及治療提供新的理想動物模型。方法: hGPI325-339、hGPI469-483多肽片段和hGPI325-339單一肽段分別與完全弗氏佐劑充分乳化后，于小鼠尾根部皮下注射進行造模，并從體重變化、足踝關節癥狀評分、足踝關節病理改變、外周血及脾組織CD4+T細胞的表達、外周血iNKT細胞比例以及血清TNF-α和IL-6水平等方面進行模型鑒定及分析。結果: 模型小鼠在造模第8 天，后爪最先出現紅腫，逐漸加重累及四肢，第14 天紅腫達到高峰，足踝腫脹，行動不利，此后開始逐漸緩解；組織形態學觀察發現足踝關節有炎癥細胞浸潤，以單核細胞與淋巴細胞為主，漿細胞少量出現，混合肽段的炎癥狀況明顯強于單肽片段。與健康對照組和單肽片段模型組相比，混合肽段模型組體重增長緩慢；外周血、脾臟CD4+T細胞數量明顯增多；炎癥高峰期外周血iNKT細胞比例下降明顯(P<0.05)，血清中TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。結論: 混合GPI肽段誘導的RA模型小鼠在免疫學特征，特別是iNKT細胞免疫病理方面與RA患者尤為接近，可作為RA免疫機制研究和治療的良好工具。

[關鍵詞]DBA/1小鼠； 葡萄糖-6-磷酸異構酶； 類風濕性關節炎； iNKT細胞

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因復雜的慢性自身免疫性疾病，以慢性、進行性、侵襲性為特點，具有高患病率、高致殘率，嚴重影響患者生活質量[1]，發病機制尚未完全闡明，且缺乏特效藥物和治療方法。近年發現恒定自然殺傷T細胞(invariant nature killer T cells，iNKT細胞)是T細胞的一個亞群，表達CD4+膜分子，具有調控炎性因子釋放的功能，與RA發病密切相關。通過研究iNKT細胞在RA中的作用機制，有可能發現RA治療的新靶標。

理想動物模型的建立對于RA發病機制研究和治療具有重要意義。目前應用廣泛且較成熟的整體動物模型有膠原誘導性關節炎、佐劑性關節炎、酵母多糖誘導的關節炎、多聚糖蛋白誘導的關節炎等十幾種[2-4]，但尚無一種模型可以完全模擬人RA的所有特征。根據研究目的構建合理的動物模型顯得尤為重要。葡萄糖-6-磷酸異構酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)被認為是廣泛應用于RA診斷及判斷活動性的一個檢測指標，利用重組人的GPI作為抗原可誘導小鼠發生與人RA病變特點相似的關節炎癥[5]。相比膠原誘導性關節炎 (collagen-induced arthritis，CIA)模型，在對CD4+T細胞的依賴性和對生物制劑反應性方面，GPI誘導的關節炎更加接近人RA特點[6]。Lisa 等[7]報道GPI325-339和GPI469-483作為GPI的活性肽片段，可誘導DBA/1小鼠RA的發生，但單一肽段的誘導效果不如整個GPI蛋白。根據結構免疫學，不同肽段有不同的作用靶點，由此推測GPI325-339和GPI469-483可能通過結合不同的靶點參與RA的病理發生。在本實驗中，我們使用hGPI325-339和hGPI469-483的混合多肽片段以及hGPI325-339單一肽段分別免疫DBA/1小鼠，并從體重變化、足踝關節癥狀評分、足踝關節病理改變、外周血及脾組織CD4+T細胞的表達、外周血iNKT細胞比例以及血清中細胞因子TNF-α和IL-6水平等多方面進行模型鑒定及特點分析，為深入RA的免疫病理研究奠定基礎。

材料和方法

1動物

DBA/1小鼠45只，雄性，8周齡，體重(20±1) g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為SCXK(京)2014-0004，SPF級飼養。

2主要試劑與儀器

多肽片段hGPI325-339(IWYINCFGCETHAML)和hGPI469-483(EGNRPTNSIVFTKLT)由北京賽百盛基因技術有限公司合成；百日咳毒素(P7208)和完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant，CFA)購自Sigma；兔抗鼠CD4抗體購自Santa Cruz；生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；PerCP標記的CD3抗體、FITC標記的CD4抗體、微量樣本多指標流式蛋白定量技術(CBA)Th1/Th2/Th17細胞因子檢測試劑盒和紅細胞裂解液購自BD；PE標記的T-selected CD1d Tetramer購自MBL；α-半乳糖神經鞘胺醇(α-galactosylceramide,α-GalCer)購自ENZO；熒光倒置顯微鏡(Olympus)；流式細胞儀Calibur和Accuri C6購自BD。

3主要方法

3.1小鼠分組DBA/1小鼠適應性飼養1周后，隨機取出15只作為健康對照組；15只小鼠進行混合肽段人工造模，為混合肽段模型組：hGPI325-339和hGPI469-483多肽片段混合溶于預冷三蒸水中(每75 μL水中溶解50 μg混合多肽)，溶解后的多肽與CFA等體積混合，充分乳化為乳化劑，每只150 μL于小鼠尾根部多點皮下注射，當天及48 h腹腔注射百日咳毒素(每只200 ng)加強免疫；剩下15只用hGPI325-339單一肽段同樣方法造模，為單一肽段模型組。

3.2小鼠體重及關節情況評估造模后，每隔4 d稱量小鼠體重，監測小鼠體重動態變化。每天觀察小鼠的一般狀況及足踝紅腫程度，并進行系統評分。對小鼠每個關節和足踝發紅腫脹程度進行量化，其評分標準為：0分，正常，表示無紅腫現象；1分，足趾有輕度紅腫；2分，有明顯可見的足背和足掌紅腫；3分，足踝紅腫，爪子各個部位均有腫脹。依此分別觀察小鼠四肢情況，所得分數累加即為此小鼠關節情況評分。

3.3流式細胞術檢測CD3+CD4+T細胞比例于造模后第8 天小鼠眼球取血，收集每只小鼠全血120 μL，各BSA 500 μL阻斷，然后加入PerCP標記的CD3抗體(1∶100)和FITC標記的CD4抗體(1∶100)各2 μL，4 ℃避光孵育20 min。之后加紅細胞裂解液1 mL，避光8 min，離心棄上清，用PBS 1 mL洗滌，最后重懸，加PBS定容至500 μL，用流式細胞儀Calibur上機檢測，FlowJo軟件(樹星公司)進行數據分析。

3.4小鼠組織取材造模后第8、14和37 天取小鼠眼球血，斷頸椎處死后置于75% 乙醇中消毒3 min，解剖剪剪下鼠爪。然后將小鼠仰臥位置于解剖盤上，打開腹腔，取出脾組織。關節組織和脾組織用75%乙醇沖洗后置于4%甲醛溶液中固定備用。

3.5小鼠關節組織HE染色足踝關節組織沖洗干凈，進行脫水、透明、石蠟包埋切片(5 μm)。然后用二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水洗。然后蘇木素染色15 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化數秒，自來水返藍15 min，水洗，1%乙醇伊紅染色3 min。最后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，于顯微鏡下觀察。

3.6小鼠脾組織免疫組化染色脾組織常規石蠟包埋切片(4 μm)，脫蠟、水化后，蒸餾水洗，0.3%甲醇雙氧水封閉內源性過氧化物酶，微波加熱抗原修復，滴加血清封閉液孵育30 min，滴加anti-CD4抗體(1∶200)，4 ℃過夜。次日，先后滴加生物素Ⅱ抗和辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS洗，DAB顯色劑顯色，自來水終止。蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。細胞膜呈棕黃色顆粒狀為陽性。

3.7流式細胞術檢測iNKT細胞比例收集各組小鼠各期全血(每只120 μL)置于流式管，BSA阻斷后加入PE標記的負載 α-GalCer的CD1d四聚體(α-GalCer用0.5%Tween-20和0.9% NaCl稀釋至200 mg/L，5 μL的α-GalCer加入100 μL CD1d Tetramer中，室溫孵育12 h)，FITC標記的anti-CD4各2 μL，4 ℃避光孵育20 min。然后加紅細胞裂解液1 mL，避光8 min，觀察澄清透亮后離心棄上清，PBS重復洗滌2次，重懸，加PBS定容500 μL，用流式細胞儀Calibur上機檢測，FlowJo軟件進行數據分析。

3.8CBA檢測細胞因子收集第8、14和37天各組小鼠全血中的血清，應用CBA 細胞因子試劑盒檢測TNF-α和IL-6水平。梯度稀釋標準品，稀釋倍數分別為1∶256、1∶128、1∶64、1∶32、1∶16、1∶8、1∶4、1∶2、1∶1。依不同濃度標準品所形成的標準曲線作為質控指標。混合捕獲微球，每個實驗管中加入50 μL捕獲微球，每個標準品管中加入50 μL梯度稀釋好的標準品，每個樣本管中加入50 μL樣本，然后所有管中加入50 μL PE檢測試劑，室溫避光孵育2 h，然后每管加入1 mL洗液，200×g離心5 min，棄上清后，每管加300 μL洗液，重懸，流式細胞儀Accuri C6上機檢測前進行質控，保證機器的可靠性。FCAP軟件(BD)進行數據分析。

4統計學處理

利用SPSS 17.0軟件進行數據分析，采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結果

1各組小鼠體重的動態變化

與健康對照組相比，RA小鼠體重增長緩慢，特別是在炎癥高峰階段呈現零增長或負增長，在炎癥轉入緩解期后，體重開始緩慢增長。健康對照組小鼠平均體重為(22.64±0.18) g，單一肽段組RA小鼠的平均體重為(22.19±0.15) g，混合肽段組小鼠的平均體重為(22.03±0.24) g。模型小鼠與健康對照組小鼠比較，差異有統計學顯著性(P<0.05)，第37天混合肽段組與單一肽段組模型小鼠的體重相比，差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖1。

Figure 1.The change of body weight of the RA mice. The area under the curve was used to indicate the relative diffe-rence. DBA1 mice were immunized with GPI peptides. Mean±SD.n=15.*P<0.05vshGPI325-339;#P<0.05vscontrol.

圖1各組小鼠體重動態變化

2RA小鼠足踝關節紅腫的觀察

模型小鼠在造模的第8 天即開始出現關節紅腫，后爪最先受累，開始僅表現為一個或幾個足趾出現紅腫，而后紅腫逐漸加重；在造模的第14 天，小鼠多關節紅腫，且有足掌甚至足踝的腫脹，后爪重于前爪，此時關節發紅腫脹程度最為嚴重，此后關節腫脹程度逐漸緩解。統計學分析關節腫脹評分，模型小鼠與健康對照組相比差異有統計學顯著性(P<0.05)，在炎癥高峰期混合肽段組比單一肽段組小鼠關節紅腫更嚴重(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Swelling of the joints and clinical scores at different time points in RA mice.Mean±SD.n=15.*P<0.05vshGPI325-339;#P<0.05vscontrol.

圖2各組小鼠不同時點關節紅腫情況和評分

3小鼠外周血中CD3+CD4+T細胞比例

造模第8天，健康對照組外周血的CD3+CD4+T細胞頻率均值為(5.24±0.36)%，單一肽段模型小鼠外周血的CD3+CD4+T細胞頻率均值為(15.98±1.06)%，而混合肽段模型小鼠的CD3+CD4+T細胞頻率為(17.76±0.22)%。混合肽段模型小鼠的CD3+CD4+T細胞頻率與健康對照組、單一肽段模型小鼠相比，差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖3。

4RA小鼠足踝關節炎細胞的浸潤情況

模型小鼠足踝關節的骨與骨之間、骨與上皮之間的滑膜下疏松結締組織可見炎性細胞包括淋巴細胞、單核細胞和漿細胞的浸潤，關節腔變窄，并且有與人RA相似的血管翳形成，混合肽段與單一肽段模型相比炎性細胞數量相對較多，見圖4。混合肽段模型小鼠不同時期浸潤的炎性細胞不同：造模第8天可見淋巴細胞、單核細胞存在；在造模第14天以淋巴細胞為主，也可見少量漿細胞；造模第37天各類炎性細胞數量明顯減少，伴大量纖維結締組織增生，見圖5。

5RA小鼠脾組織的病理變化

健康對照組脾組織中CD4+T細胞數量較少，而模型組小鼠脾組織中CD4+T細胞數量明顯升高(P<0.05)，各組之間比較差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖6。

6小鼠外周血的iNKT細胞比例

健康對照組的iNKT細胞比例為(0.39±0.03)%；單一肽段模型小鼠的比例為(0.17±0.07)%，混合肽段模型小鼠的比例為(0.11±0.02)%，造模第8天的iNKT細胞比例為(0.20±0.04)%，第14 天為(0.04±0.13)%，第37天為(0.22±0.34)%。第14天混合肽段模型小鼠的iNKT細胞比例顯著下降，與其它組相比差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖7。

Figure 3.The proportion of CD3+CD4+T cells in peripheral blood of RA mice on the 8th day.Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol.

圖3第8天各組小鼠外周血CD3+CD4+T細胞比例

Figure 4.Histopathological changes of the ankle joint in different groups on day 14 (×100).

圖4第14天各組小鼠關節組織HE染色對比圖

Figure 5.Histopathological changes of the ankle joint in hGPI325-339+hGPI469-483 RA mice (×400).→: monocytes; ↓：lymphocytes; oblique ↓: plasma cells.

圖5混合肽段模型組不同時點足踝關節HE染色對比圖

Figure 6.The expression of CD4+T cells in splenic tissue in different groups (×400).

圖6各組小鼠脾組織淋巴細胞膜CD4+T細胞表達情況

Figure 7.The proportion of iNKT cells in peripheral blood of RA mice.Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol.

圖7各組小鼠外周血iNKT細胞頻率

7RA小鼠血清中細胞因子的變化

檢測第8、14和37天小鼠血清中細胞因子TNF-α 和IL-6的水平，發現模型組的TNF-α和IL-6第8天含量上升，在第14天到達最高峰，第37 天含量下降，且第14天時混合肽段模型小鼠的TNF-α水平較單一肽段模型組比較差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖8。

討論

RA是累及全身大小關節和多器官的自身免疫病，機體的免疫失衡和過度炎癥反應是其發病基礎：機體自身反應性CD4+T細胞的過度增殖打破了原有細胞間平衡，出現了Th1和Th17亞群過度增殖，Th2和Treg被抑制[8]。iNKT細胞是一群兼具NK細胞功能和T細胞特點的特殊細胞群，通過分泌多種細胞因子和趨化因子，調控CD4+T細胞的分化方向，影響免疫應答的格局，是免疫系統的“瑞士軍刀”[9]。研究發現，RA患者體內存在iNKT細胞比例和功能的缺陷[10]，外周血中iNKT細胞比例與IFN-γ/IL-4比值呈負相關[11]。

GPI存在于大多數RA患者血清和關節液中，是當前臨床RA診斷及判斷活動性的一個常用檢測指標[12]。Schubert 等[5]用重組人GPI免疫小鼠，小鼠關節腫脹變形，炎細胞浸潤，血管翳形成。Bruns等[7]報道GPI325-339和GPI469-483作為GPI的活性片段，均可誘導RA的發生，其致炎率前者高于后者。本研究發現，混合肽段的誘導效果優于單一肽段hGPI325-339，這可能與混合肽段通過多個作用靶點激活免疫應答有關。因此，在本實驗中我們以單一肽段hGPI325-339為對照，使用混合多肽片段免疫DBA/1小鼠，結果無論從體重變化、足踝關節癥狀評分、關節病理改變、外周血及脾組織CD4+T細胞的表達、外周血iNKT細胞比例和血清細胞因子TNF-α、IL-6水平等方面，混合肽段的誘導效果均優于單肽段。混合肽段模型小鼠足踝關節在造模的第8 天出現腫脹，組織病理以單核細胞浸潤為主，第14 天炎癥到達高峰，伴食欲減退、活動受限、行動不利，組織病理以淋巴細胞為主，偶見漿細胞，進入緩解期后，炎癥減輕，炎細胞數量顯著減少，大量纖維組織增生，這些均符合RA慢性、以滑膜炎性改變為主的特點。混合肽段模型組外周血和脾組織的CD4+T細胞過度增殖，而iNKT細胞在炎癥高峰期明顯降低，與RA患者iNKT細胞的改變趨勢一致[10]，故我們推測，CD4+T細胞在外周血和脾組織的大量增殖，提示體內出現細胞免疫異常，可能是由于多肽抗原刺激了胸腺中CD4+T細胞的成熟，并向外周器官不斷遷移，而外周血中iNKT細胞比例和功能的缺陷，一方面可能由于炎癥初始階段iNKT細胞的過度活化導致細胞衰竭；另一方面可能由于體內慢性炎癥的刺激使得可以遞呈抗原給iNKT細胞的CD1d減少，致使iNKT細胞活化降低，功能缺陷[13]。此外，血清中TNF-α和IL-6含量升高，提示模型小鼠體內存在與RA患者相似的Th1和Th17亞群的極化[8, 14]，在抗原和炎癥因子的作用下，iNKT細胞不僅自身能迅速釋放大量的炎性細胞因子和趨化因子，而且能調控多種免疫細胞(Treg細胞、DC細胞、B細胞和NK細胞等)的分化方向[15]，促進以TNF-α為代表的炎性因子的釋放，進而影響RA免疫應答格局，但具體iNKT細胞參與RA的發病機制還需進一步探討。

綜上所述，應用hGPI325-339和hGPI469-483混合多肽片段誘導的RA模型，可以模擬人RA體內CD4+T細胞過度增殖和iNKT細胞缺陷等特點，可作為RA細胞免疫研究的理想動物模型。

Figure 8.The serum levels of TNF-α and IL-6 in RA mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vshGPI325-339+hGPI469-483.

圖8RA小鼠血清細胞因子TNF-α和IL-6水平

[參考文獻]

[1]Lee DM, Weinblatt ME. Rheumatoid arthritis[J]. Lancet, 2001, 358(9285):903-911.

[2]Schurgers E, Billiau A, Matthys P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-γ[J]. Interferon Cytokine Res, 2011, 31(12):917-926.

[3]Griffiths MM, Remmers EF.Genetic analysis of collagen-induced arthritis in rats: a polygenic model for rheumatoid arthritis predicts a common framework of cross-species inflammatory/autoimmune disease loci[J]. Immunol Rev, 2001, 184(1):172-183.

[4]van Haalen HG, Severens JL, Tran-Duy A, et al. How to select the right cost-effectiveness model?A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation model for rheumatoid arthritis[J]. Pharmacoeconomics, 2014, 32(5):429-442.

[5]Schubert D, Maier B, Morawietz L, et al. Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-depen-dent peripheral polyarthritis in generally unaltered mice[J]. J Immunol, 2004, 172(7):4503-4509.

[6]Horikoshi M, Goto D, Segawa S, et al. Activation of invariant NKT cells with glycolipid ligand a-galactosylceramide ameliorates glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis[J]. PLoS One, 2012, 7(12):e51215.

[7]Bruns L,Frey O, Morawietz L, et al. Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice[J]. Arthritis Res Ther, 2009, 11(4):R117.

[8]Boissier MC, Assier E, Falgarone G, et al. Shifting the imbalance from Th1/Th2 to Th17/treg: the changing rheumatoid arthritis paradigm[J]. Joint Bone Spine, 2008, 75(4):373-375.

[9]Matsuda JL, Mallevaey T, Scott-Browne J, et al. CD1d-restricted iNKT cells, ′the swiss-army knife′ of the immune system[J]. Curr Opin Immunol, 2008, 20(3): 358-368.

[10]Parietti V, Chifflot H, Sibilia J,et al. Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis[J]. Clin Immunol,2010,134(3):331-339.

[11]孟明，陳丹，許鳴華，等. RA患者iNKT細胞頻率與IFN-γ/IL-4的相關性研究[J]. 中華微生物和免疫學雜志, 2015, 35(3):213-218.

[12]Zong M, Lu T, Fan S, et al. Glucose-6-phosphate isome-rase promotes the proliferation and inhibits the apoptosis in fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Res Ther, 2015,17:100.

[13]Kojo S, Adachi Y, Keino H, et al. Dysfunction of T cell receptor AV24AJ18+, BV11+ double-negative regulatory natural killer T cells in autoimmune diseases[J]. Arthritis Rheum, 2001, 44(5):1127-1138.

[14]Yoshida Y, Mikami N, Matsushima Y, et al. Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model[J]. Biol Pharm Bull, 2015, 38(8):1120-1125.

[15]Patel O, Cameron G, Pellicci DG, et al. NKT TCR recognition of CD1d-α-C-galactosylceramide[J]. J Immunol, 2011, 187(9):4705-4713.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA/1 mice

ZHANG Xue-jiao1, LIU Jia-lin1, 2, YANG Fei1, LOU Yong-fu1, WANG Qiang1, CHEN Dong-zhi1, MENG Ming1

(1HebeiUniversityHealthScienceCenter,Baoding071000,China;2InstituteofLaboratoryAnimalSciences,ChineseAcademyofMedicalSciences,TheComparativeMedicineCenter,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100021,China.E-mail:mengming127@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To establish an animal model of rheumatoid arthritis (RA) in DBA/1 mice induced by immunodominant mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase (GPI). METHODS: The DBA/1 mice were immunized with emulsified mixed peptide fragments of hGPI325-339+hGPI469-483 or single peptide hGPI325-339 in complete Freund′s adjuvant by subcutaneous injection to induce the model of RA. Body weight, ankle joint symptom scores, the pathological change of the ankle joint, the levels of CD4+ T cells in the spleen and peripheral blood, the proportion of iNKT cells in the peripheral blood, and the levels of TNF-α and IL-6 in serum were detected to evaluate and analyze the model. RESULTS: The hind paw of the model mice appeared red swelling on the 8th day, and then aggravated gradually to the limbs. The red swelling reached peak on the 14th day, and then relieved gradually. Inflammation response dominated by lymphocytes and monocytes was observed in the ankle joint. The inflammatory effect of mixed peptides was more obvious than that of the single one (P<0.05). Compared with control group and the mice treated with single peptide, the weight gain was slow, the amount of CD4+ T cells in the peripheral blood and spleen were increased, the proportion of peripheral iNKT cells in the inflammatory peak was decreased (P<0.05), and the serum level of TNF-α was increased significantly (P<0.05) in the mice treated with mixed peptide fragments. CONCLUSION: The immunological characteristics of RA model induced by mixed GPI peptides in DBA/1 mice is closer to that in RA patients, especially in the immunopathology of iNKT cells. Therefore, this model can be used as a new tool for studying the mechanism and immunological intervention of RA.

[KEY WORDS]DBA/1 mice; Glucose-6-phosphate isomerase; Rheumatoid arthritis; iNKT cells

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.031

[中圖分類號]R363.2; R593.22

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0312-5079024； E-mail: mengming127@163.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81373197)；河北省自然科學基金資助項目(No.H2014201133; No.H2015201131)；河北大學醫學學科建設基金資助項目(No.2014A1001; No.2014A1002)；國家級大學生創新項目基金資助項目(No.201510075030);保定市科學技術研究與發展指導計劃(No.14ZF003)

[收稿日期]2015- 08- 03[修回日期] 2015- 12- 07

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0569- 08

雜志網址： http://www.cjpp.net

·實驗技術·