二十二碳六烯酸抑制氧化應激狀態下人視網膜色素上皮細胞凋亡*

劉越峰，　羅衛民，　張　勇，　鐘曉東

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院 1眼科中心, 2心胸外科，湖北 十堰 442000)

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二十二碳六烯酸抑制氧化應激狀態下人視網膜色素上皮細胞凋亡*

劉越峰1，羅衛民2△，張勇1，鐘曉東1

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院1眼科中心,2心胸外科，湖北 十堰 442000)

[摘要]目的： 觀察二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)對外源性H2O2誘導人視網膜色素上皮細胞凋亡的影響及分子機制。方法： 體外培養人視網膜色素上皮細胞系ARPE-19，加入終濃度為12.5 mol/L的H2O2誘導氧化應激，隨后用30～100 μmol/L DHA作用細胞4～24 h；real-time PCR和Western blot分別檢測血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1) mRNA和蛋白的表達；比色法分析HO-1酶活性；熒光探針檢測活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產生；免疫熒光檢測轉錄因子NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)的核轉位。最后通過HO-1 siRNA干擾后，流式細胞術觀察其對ARPE-19細胞凋亡的影響。結果： DHA能以濃度依賴性方式誘導ARPE-19細胞表達HO-1 mRNA和蛋白，同時，HO-1的酶活性也隨著DHA濃度的遞增而增強；DHA處理也能誘導Nrf2核轉位。此外，H2O2處理可促進ARPE-19細胞凋亡，并誘導其產生ROS。同時給予100 μmol/L DHA處理后，細胞凋亡率和ROS生成顯著降低。轉染HO-1 siRNA或用HO-1抑制劑ZnPP處理后，可明顯降低DHA對細胞凋亡率和ROS的抑制作用。結論： DHA可能通過Nrf2途徑誘導視網膜色素上皮細胞表達HO-1，從而發揮對細胞的保護作用。

[關鍵詞]二十二碳六烯酸； 視網膜色素上皮細胞； 血紅素氧合酶-1

年齡相關性黃斑變性(age-related macular dege-neration，AMD)是一種黃斑神經疾病，好發于50歲以上人群，其病理生理特征是患者出現雙側進行性視網膜黃斑部退行性病變，是老年人群常見的致盲性眼病之一[1-2]。目前AMD的病因和發病機制尚不完全明了。流行病學研究表明它是一種與環境以及遺傳有關的多因素疾病[3]，其中氧化應激機制在本病的發生發展過程中發揮核心作用。由于黃斑部解剖學與組織學的特殊性，視網膜色素上皮細胞是AMD發生的中心環節。目前臨床上針對AMD尚無有效的治療方法，主要通過針對晚期脈絡膜新生血管病干預為主的綜合治療，但治療效果欠佳，僅有20%～40%患者的視力得到一定改善[4]。有研究發現，二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)在中樞神經系統的發育及其功能功能方面發揮重要作用。如DHA可以通過影響凋亡相關基因的表達而降低大鼠腦部的缺血再灌注損傷，減少神經細胞的凋亡[5]。此外，DHA不但具有抗氧化應激、抗神經炎性反應[6]，另外對黃斑變性以及阿爾茨海默病等神經變性性疾病具有一定的預防和保護作用[7]。本研究旨在探討DHA對氧化應激狀態下人視網膜色素上皮細胞凋亡的影響，從而進一步明確其在AMD保護作用中的分子機制。

材料和方法

1主要實驗試劑

ARPE-19細胞購自ATCC；DMEM培養基、無內毒素胎牛血清購自Gibco；DHA、β-actin多克隆抗體、熒光探針H2DCFDA、HO-1抑制劑ZnPP、激動劑CoPP為Sigma產品；抗HO-1多克隆抗體、抗Nrf2多克隆抗體以及C3標記羊抗鼠多克隆抗體購自Santa Cruz；細胞蛋白提取試劑盒和Bradford蛋白濃度測定試劑為Pierce產品；Nrf2和HO-1 siRNA由廣州銳博公司合成；siRNA轉染試劑盒購自Qiagen；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自Roche；HO-1活性檢測試劑盒購自GENMED。

2主要實驗方法

2.1細胞培養與處理ARPE-19細胞用DMEM培養基(含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺和抗生素)，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。待細胞生長至密度為80%后接種至6孔板中，并改用含1%血清的DMEM培養基培養24 h。隨后細胞加入不同濃度的DHA作用4～24 h。

2.2細胞總蛋白提取與Western blot實驗ARPE-19細胞經DHA處理結束后，用PBS漂洗1次，加入含蛋白酶抑制劑的Cocktails裂解細胞。采用Pierce公司試劑盒提取胞漿蛋白，并用Bradford法測定蛋白濃度。獲取20 μL蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，經轉膜、封閉后，加入相應的 I 抗和 II 抗孵育，ECL顯影、拍照。

2.3HO-1酶活性分析收集處理后細胞，1 000 r/min離心8 min。根據試劑盒操作步驟裂解細胞，并設置好背景管和樣品管，分別加入340 μL緩沖液、20 μL反應液和20 μL底物混勻，37 ℃溫育60 min后加入400 μL終止液。經1 000 r/min離心 5 min后，獲取綠色相，酶標儀上設置波長為464 nm和530 nm，根據取其吸光度計算出HO-1的活性，結果以每毫克蛋白中每小時生成的膽綠素含量表示。

2.4免疫熒光觀察Nrf2核轉位ARPE-19細胞處理完畢后，用3.5%多聚甲醛重懸浮細胞，室溫固定15 min。經甲醇通透10 min，洗滌后用1%羊血清封閉30 min。隨后加入抗Nrf2抗體，室溫孵育2 h。洗滌后繼續加入C3標記羊抗鼠II 抗孵育1 h，激光共聚焦顯微鏡(Nikon C2 Plus)拍照。

2.5活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的測定ARPE-19細胞處理完畢后加入終濃度5 μmol/L的H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min。PBS洗細胞并重懸細胞，熒光分光光度計(SynergyHT，Bio-Tec)測量熒光強度(激發波長485 nm，發射波長530 nm)，計算相對熒光值(relative fluorescence intensity，RFI)。

2.6細胞轉染生長于培養皿中的ARPE-19細胞(約5×105個)在轉染前更換為無血清培養基培養18～24 h。將100 nmol/L HO-1 siRNA或對照siRNA與轉染試劑混合后，加至細胞培養液中。4 h后用無菌PBS漂洗細胞，并更換為完全培養基，隨后加入DHA用于下一步研究。

2.7凋亡檢測取1 mL細胞(約5×105個)，加入195 μL結合液重懸細胞后，繼續加入5 μL Annexin V-FITC使總體積為200 μL，并混勻，室溫避光10 min；離心棄上清，再次用190 μL結合液重懸細胞，繼續加入10 μL PI染液，4 ℃避光10 min后用于流式細胞術分析。

3統計學處理

所有實驗數據均為3組實驗結果的平均值，并重復3次，應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，并采用單因素方差分析數據后行SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1DHA誘導ARPE-19細胞表達HO-1 mRNA

Real-time PCR結果顯示，DHA作用ARPE-19細胞8 h后，HO-1的mRNA表達隨著DHA濃度增加而增加。此外，100 μmol/L DHA在不同的時點誘導HO-1的mRNA表達量也有所不同。其中DHA作用4 h后，HO-1的mRNA開始升高，8～12 h達到峰值，24 h時接近對照組水平，見圖1。

Figure 1.DHA induced the mRNA expression of HO-1 in the ARPE-19 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L;#P<0.05,##P<0.01vs0 h.

圖1DHA誘導ARPE-19細胞表達HO-1 mRNA

2DHA上調HO-1蛋白表達并增強其酶活性

Western blot結果顯示，0、30、50和100 μmol/L DHA與ARPE-19細胞孵育8 h后，HO-1蛋白的表達水平隨之增多，呈一定的劑量依賴性。此外，100 μmol/L DHA作用ARPE-19細胞4 h后，HO-1酶活性逐漸增高，16 h后開始下降，見圖2。

Figure 2.DHA induced ARPE-19 cells to express HO-1 protein and upregulated its enzymic activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖2DHA誘導HO-1蛋白表達并增高其酶活性

3DHA經Nrf2誘導HO-1表達

ARPE-19細胞在DHA處理前，Nrf2位于細胞漿中。經20～100 μmol/L DHA處理4 h后，細胞核中Nrf2顯著增多，采用siRNA干擾Nrf2表達后，HO-1表達顯著降低，見圖3。

4抑制HO-1表達減弱DHA對ARPE-19細胞凋亡的抑制作用

流式細胞術結果顯示，H2O2處理可誘導ARPE-19細胞凋亡。而同時給予100 μmol/L DHA處理8 h后，與H2O2處理組相比，細胞凋亡率明顯降低。而在DHA干預的同時給予5 μmol/L HO-1抑制劑ZnPP處理，或采用siRNA干擾HO-1表達后，可明顯逆轉DHA對細胞凋亡的抑制效應，而給予10 μmol/L HO-1激動劑CoPP處理后，得到了與DHA類似的效果，見圖4。

5抑制HO-1表達減弱DHA對ROS產生的抑制作用

H2O2處理可明顯誘導ARPE-19細胞產生ROS。DHA可有效降低H2O2對細胞ROS的誘生作用。HO-1抑制劑ZnPP和siRNA處理后，ROS含量恢復至H2O2組水平；而DHA聯合HO-1激動劑CoPP能進一步降低ROS的含量，見圖5。

Figure 3.DHA induced HO-1 expression via Nrf2. A: DHA induced Nrf2 nuclear translocation; B: silencing ofNrf2 down-regulated HO-1 expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L;#P<0.05vs100 μmol/L DHA.

圖3DHA經Nrf2誘導HO-1表達

討論

HO-1是降解血紅素代謝為CO、Fe2+和膽綠素的限速酶。多種病理生理狀態，如氧化應激、感染、糖尿病和視網膜病變等因素均可上調其表達[8]。研究發現，多種對AMD具有保護作用的抗氧化治療藥物是通過上調HO-1的表達而實現的[9-11]。HO-1可通過其產物CO、膽紅素和Fe2+而發揮細胞保護作用，包括降低TNF-α的促凋亡毒性[12]，維持血管內皮細胞的生理功能，減輕炎癥和氧化應激損傷[13]。DHA是含有22個碳原子的長鏈不飽和脂肪酸，是人體內不飽和程度最高的脂肪酸之一，其高度不飽和性可影響膜蛋白活性、信號轉導及受體功能。研究表明，DHA可有效改善光損傷所致的視網膜氧化應激反應，并能上調內源性抗氧化蛋白的表達[14-15]。本研究通過體外培養視網膜色素上皮細胞ARPE-19，通過DHA干預后，結果發現，30 μmol/L的DHA即可能誘導HO-1 mRNA和蛋白表達，同時能上調其酶活性。基于HO-1多方面的細胞保護效應，以上結果表明DHA可能通過上調HO-1的表達從而減輕視網膜色素上皮細胞的氧化應激水平。

Nrf2是一種重要的氧化應激轉錄保護因子。生理條件下Nrf2存在于胞漿中，并與胞漿中抑制蛋白Keap1相結合。當細胞受到各種外源性刺激時，Keap1經泛素化降解而促使其與Nrf2分離。Nrf2隨后轉移至細胞核內與基因 5’非編碼區的抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)相結合而啟動相關基因的轉錄[16]。本研究也發現DHA處理后，Nrf2轉移至細胞核內而調控HO-1的表達。同時，采用Nrf2 siRNA沉默后發現，HO-1的表達顯著減少，這表明Nrf2參與了HO-1的表達。

Figure 4.The effect of inhibition of HO-1 expression on ARPE-19 cells apoptosis. 1: control; 2: H2O2; 3: H2O2+DHA; 4: H2O2+DHA+ZnPP; 5: H2O2+DHA+HO-1 siRNA; 6: H2O2+DHA+CoPP. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsH2O2;#P<0.05vsH2O2+DHA.

圖4抑制HO-1表達對ARPE-19細胞凋亡的影響

Figure 5.The effect of inhibition of HO-1 expression on ROS production in the ARPE-19 cells. 1: control; 2: H2O2; 3: H2O2+DHA; 4: H2O2+DHA+ZnPP; 5: H2O2+DHA+HO-1 siRNA; 6: H2O2+DHA+CoPP. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsH2O2;#P<0.05vsH2O2+DHA.

圖5抑制HO-1表達對ARPE-19細胞ROS產生的影響

由于細胞凋亡是AMD發生的根本原因，因此本研究隨后對HO-1在氧化應激條件下的細胞護作用進行了觀察，首先采用HO-1抑制劑ZnPP和DHA共同與ARPE-19細胞孵育，結果發現ZnPP可顯著降低DHA對細胞凋亡和ROS產生的抑制作用。此外，通過siRNA干擾HO-1表達后也得到了類似結果。另外本研究也從正向方面得到了驗證，即，DHA處理的同時加入HO-1激動劑CoPP共同孵育，與單純DHA處理相比，凋亡率和ROS的產生進一步降低。以上結果證明DHA可能通過上調HO-1表達，從而改善ARPE-19細胞的氧化應激狀態及凋亡。

總之，本課題研究結果說明，DHA可激活視網膜色素上皮細胞Nrf2并誘導HO-1的表達。HO-1的上調可減少氧化應激損傷后視網膜色素上皮細胞凋亡以及ROS的產生，最終發揮對其保護作用，在隨后的研究中，我們將對HO-1抗凋亡機制開展進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Docosahexaenoic acid protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress-induced apoptosis

LIU Yue-feng1, LUO Wei-min2, ZHANG Yong1, ZHONG Xiao-dong1

(1DepartmentofOphthalmology,2DepartmentofCardiothoracicSurgery,TaiheHospitalofShiyanAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China.E-mail:weiminluo120@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of docosahexaenoic acid (DHA) on H2O2-induced apoptosis in human retinal pigment epithelium cells and its molecular mechanism. METHODS: Human retinal pigment epithelium cell line ARPE-19 was cultured in vitro, and 12.5 mmol/L H2O2 was used to mimic the oxidative stress condition. The cells were treated with 30～100 μmol/L DHA for 4～24 h. The expression of heme oxygenase-1 (HO-1) at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blot, respectively. The enzymic activity of HO-1 was measured by colorimetry. Production of reactive oxygen species (ROS) was determined by fluorescent probe. Activation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) was examined by immunofluorescence method. Apoptosis of ARPE-19 cells was analyzed by flow cytometry. RESULTS: The mRNA and protein expression and the enzymic activity of HO-1 were significantly increased in the ARPE-19 cells after DHA treatment. Meanwhile, nuclear translocation of Nrf2 was also observed. Apoptosis appeared and ROS was produced upon H2O2 incubation. In contrast, DHA at 100 μmol/L significantly abrogated H2O2-induced apoptosis and ROS production. Furthermore, silencing of HO-1 by specific siRNA, or treatment with ZnPP, an inhibitor of HO-1, partly counteracted the protective effect against H2O2-induced apoptosis and ROS production. CONCLUSION: DHA protects retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via induction of heme oxygenase-1 expression after Nrf2 activation.

[KEY WORDS]Docosahexaenoic acid; Retinal pigment epithelial cells; Heme oxygenase-1

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.019

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0719-8801710； E-mail: weiminluo120@163.com

*[基金項目]十堰市科學技術研究與開發項目(No. 14Y40)

[收稿日期]2015- 09- 15[修回日期] 2016- 02- 04

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0504- 06

雜志網址： http://www.cjpp.net