Livin基因修飾的骨髓間充質干細胞移植治療對急性心肌梗死大鼠心功能的影響*

鄒　兵，　謝軍平，　吳清華△，　陳受琳，　肖魯閩，　蘇　海，　洪　葵，　吳延慶，　程曉曙

(南昌大學第二附屬醫院 1心血管內科， 2呼吸內科， 3麻醉科，江西 南昌 330006)

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Livin基因修飾的骨髓間充質干細胞移植治療對急性心肌梗死大鼠心功能的影響*

鄒兵1，謝軍平2，吳清華1△，陳受琳3，肖魯閩1，蘇海1，洪葵1，吳延慶1，程曉曙1

(南昌大學第二附屬醫院1心血管內科，2呼吸內科，3麻醉科，江西 南昌 330006)

[摘要]目的： 探討livin修飾的骨髓間充質干細胞(MSCs)移植改善急性心肌梗死大鼠心功能的作用及livin和促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9在感染后的表達情況。方法: 通過全骨髓培養法分離培養骨髓間充質干細胞，感染攜帶livin基因的重組腺病毒后用流式檢測其對MSCs凋亡的影響。通過Western blot法分別檢測livin、caspase-3、caspase-7和caspase-9的蛋白表達情況。采用冠狀動脈左前降支結扎法建立心肌梗死模型，然后實驗分4組進行：無胎牛血清的DMEM組；單純干細胞治療組(MSCs組)；空載腺病毒轉染干細胞組(rAd-control/MSCs)組；livin基因轉染干細胞組(rAd-livin/MSCs組)。1個月后采用生理儀記錄各組大鼠左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)來評價大鼠心功能。結果: rAd-livin/MSCs組凋亡率較MSCs組和rAd-control/MSCs組顯著降低(P<0.05)；rAd-livin/MSCs組抗凋亡蛋白livin明顯上升(P<0.05)，促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7及caspase-9表達顯著下降(P<0.05)；細胞移植后1個月，rAd-livin/MSCs組心功能比MSCs組改善更明顯(P<0.05)。結論: rAd-livin感染MSCs后可促進抗凋亡蛋白livin的表達，同時降低促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7和caspase-9的表達及細胞凋亡率。rAd-livin/MSCs移植能進一步改善心肌梗死大鼠心功能。

[關鍵詞]Livin基因； 間充質干細胞； 心肌梗死； 心功能

隨著對急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后再灌注治療和藥物治療研究的進展，急性心肌梗死患者的生存率明顯提高。但心肌梗死后，壞死心肌細胞不能再生而由纖維組織代替，由此可產生左心室重塑、心律失常和心力衰竭。雖然骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植能改善心梗后心功能，但使用現有的方法移植到損傷局部組織的MSCs增殖能力有限[1]，大部分細胞因環境不適而死亡，難以達到預期治療效果。Livin是近年來發現的人類凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成員。有研究顯示livin抗凋亡作用強于其它IAP家族成員[2]。因此，本研究擬利用重組腺病毒把livin基因轉移到MSCs中，并實現livin基因在MSCs中的表達，進而探討livin基因修飾的大鼠骨髓MSCs移植后存活率及對心肌梗死大鼠心功能的影響。

材料和方法

1大鼠骨髓 MSCs的分離培養和擴增

無菌條件下取大鼠兩側股骨和脛骨，鉗掉骨端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器吸取含有20%胎牛血清的完全培養液4 mL沖出骨髓，收集在離心管中，用移液管反復吹打成單細胞懸液，移至培養瓶中。于48 h后半量換液， 5 d后全量換液，以后每2～3 d換液1次，待細胞生長至90%時，以1∶3傳代，第3～5代培養的MSCs用于實驗。

2實驗方法

2.1流式細胞術檢測rAd-livin 感染對MSCs凋亡的影響取第3代MSCs，至覆蓋率達70%時，根據最佳的MOI值(1∶600)用rAd-livin或空載體腺病毒rAd-control(購自上海英濰捷基貿易有限公司)進行感染，感染24 h后換液，繼續培養48 h，取rAd-livin/MSCs、rAd-control/MSCs及未感染的MSCs各1 mL(1×109/L)，4 ℃ 1 000 r/min離心10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗，重復3次后將細胞重懸于200 μL結合緩沖液，加入10 μL Annexin V-FITC，避光反應15 min后，加入300 μL結合緩沖液和5 μL PI，經流式細胞儀檢測，Cell Quest軟件分析。

2.2Western blot檢測抗凋亡蛋白livin及促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9在細胞中的表達水平收集rAd-livin/MSCs、rAd-control/MSCs及未感染的MSCs提取蛋白。以考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電泳完畢，濕轉至硝酸纖維素濾膜，50 g/L脫脂奶室溫封閉2 h后，分別加入兔抗鼠livin、caspase-3、caspase-7和caspase-9 Ⅰ抗，室溫孵育30 min，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的 II 抗(1∶3 000)，室溫孵育l h，TBST洗滌4次，每次15 min，ECL顯影。以β-actin為內參照。用Quantity One軟件對Western blot條帶進行灰度分析。

2.3大鼠心肌梗死模型的制備及分組術前1 d禁食，取SD大鼠進行稱重(250～300 g，由南昌大學實驗動物中心提供)，采用冠狀動脈左前降支結扎法建立心肌梗死動物模型。心肌梗死模型成功15 min后，大鼠隨機分為4組(每組15只)，通過直視下分5點在心肌梗死區及其心梗交界區注射移植細胞。DMEM組注射無胎牛血清100 μL； MSCs組注射MSCs(100 μL，約l×106個細胞)；rAd-control/MSCs組注射空載體感染的MSCs (100 μL，約l×106個細胞)；rAd-livin/MSCs組注射 rAd-livin感染的MSCs (100 μL，約1×106個細胞)。注射后不縫心包，逐層縫合肌肉、皮膚。術后每只大鼠肌肉注射青霉素1×105U/d以預防感染，加強營養，維持1周。

2.4左心室功能的測定細胞移植4周后，用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，沿頸部正中切開，游離右頸總動脈，于遠心端將頸動脈扎死，近心端將血流阻斷，用手術剪在其中間呈45°朝近心端剪一個V字形切口，將20 G導管插入，恢復近心端的血流，進一步將導管插入左心室，另一端接上4道生理記錄儀，記錄大鼠最大左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、最大左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)；連續測取5次數據，每次間隔3 min，每1數據由3次較穩定數據求平均值作為結果。

3數據處理和統計學分析

用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析,所有計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1轉染后細胞凋亡率的變化

轉染后rAd-livin組的細胞凋亡率較MSCs組降低(P<0.05)，較rAd-control組顯著降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The apoptotic rate of the MSCs detected by flow cytometry. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsrAd-livin group.

圖1經流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況

2轉染后livin、caspase-3、caspase-7和caspase-9蛋白的表達

分別提取正常MSCs和經空載與目的基因轉染處理后MSCs的蛋白，Western blot結果顯示與MSCs和rAd-control組相比，rAd-livin組livin的表達顯著增高(P<0.05)，而caspase-3、caspase-7和caspase-9的表達明顯下降(P<0.05)，見圖2。

3心功能測定結果

細胞移植4周后，用生理記錄儀記錄大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax，其結果顯示，rAd-livin/MSCs組、rAd-control/MSCs組和MSCs組的LVSP、LVEDP、 +dp/dtmax和-dp/dtmax較DMEM組都顯著增加(P<0.05)，rAd-livin/MSCs組較MSCs組增加更明顯(P<0.05)，見表1。

討論

隨著對危險因素的控制、藥物與介入治療，心肌梗死患者的生存數量與質量雖然得到了明顯的提高與改善。然而，現有治療方式并不能直接抑制心肌梗死患者的瘢痕形成與心室重構及其引起的心力衰竭與心律失常。通過干細胞移植可以穩定病損心臟結構，防止心肌重塑，避免導致充血性心衰，改善局部或總體心肌的收縮功能，干細胞移植治療改善心功能成為一種新的治療方式。然而，盡管在動物實驗和臨床實驗都顯示，干細胞移植能夠改善心功能，但是移植后的干細胞注入心肌后其存活率很低[3]，于是Saini等[4]將MSCs進行高壓氧或凋亡蛋白酶抑制劑(CI)處理后再進行移植，結果顯示無論是高壓氧處理組還是CI組，其凋亡率都顯著降低，而且同時進行高壓氧和CI處理后，其凋亡率降低更顯著，基因和蛋白表達檢測表明其促凋亡蛋白caspase-1、-3、-6、-7和-9都顯著降低，而保護性蛋白Akt、NF-κB和Bcl-2的表達則顯著增加。Zhang等[5]則發現阿托伐他汀能夠增加MSCs移植與成活率，且經阿托伐他汀處理后促凋亡蛋白Bim和Bax的表達降低，而抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2的表達是增加的。Li等[6]將bcl-2基因修飾的MSCs移植入心肌梗死大鼠模型，發現Bcl-2能夠增加移植后的MSCs的存活率，使得心功能明顯改善。

Figure 2.The expression of livin, caspase-3, caspase-7 and caspase-9 in MSCs after rAd-livin transfection. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsrAd-livin group.

圖2MSCs細胞在轉染后livin、caspase-3、caspase-7和caspase-9蛋白的表達情況

表1移植后4周各組LVSP、LVEDP、 +dp/dtmax和-dp/dtmax的比較

Table 1.The comparison of LVSP, LVEDP, +dp/dtmaxand -dp/dtmaxbetween groups 4 weeks after transplantation (Mean±SD.n=11～13)

GroupLVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)DMEM115.13±6.1114.66±0.955206.13±249.224275.10±362.15MSCs127.64±4.14*11.25±1.04*6837.08±220.78*5631.74±381.15*rAd-control/MSCs125.47±5.63*12.05±1.32*6516.33±229.17*5598.21±342.39*rAd-livin/MSCs138.12±4.86*#7.88±1.14*#7251.49±316.13*#6337.45±355.17*#

*P<0.05vsDMEM group;#P<0.05vsMSCs group.

Livin是近年來發現的人類IAP家族的新成員，其能夠結合并抑制caspase-3、caspase-7和caspase-9的凋亡作用[7-9]。且有研究顯示livin抗凋亡作用強于其它IAP家族成員[2]。

本實驗通過重組腺病毒與抗凋亡基因livin重組后感染BMSCs，可使BMSCs的凋亡率降低，抗凋亡蛋白livin表達增加，而促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7和caspase-9 的表達都下調。在心肌梗死大鼠體內的實驗也證實轉染目的基因后，能更好地改善心肌梗死大鼠的心功能，雖然作用機制及安全性仍需進一步的研究，但這不失為一種提高移植后MSCs存活率并進一步提高其改善心肌梗死心功能的方法。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect oflivin-modified BM-MSCs transplantation on cardiac function following acute myocardial infarction in a rat model

ZOU Bing1, XIE Jun-ping2, WU Qing-hua1, CHEN Shou-lin3, XIAO Lu-min1, SU Hai1, HONG Kui1, WU Yan-qing1, CHENG Xiao-shu1

(1DepartmentofCardiology,2DepartmentofRespiratory,3DepartmentofAnesthesiology,TheSecondAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:ncwqh@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the effect of livin gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) transplantation on the cardiac function following acute myocardial infarction in a rat model and the expression of livin, caspase-3, caspase-7 and caspase-9 in the livin gene-modified BM-MSCs. METHODS: The MSCs were obtained by the whole bone marrow culture method, and the apoptosis of the MSCs after infection with adenovirus vector carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene and livin recombinant vector (rAd-livin) were detected by flow cytometry. The expression of livin, caspase-3, caspase-7 and caspase-9 was detected by Western blot. After permanent left anterior descending artery occlusion, the rats were randomized to receive intramyocardial injection of DMEM without cells (vehicle group), or containing MSCs (MSCs group), MSCs (EGFP) (rAd-control/MSCs group) or MSCs (livin) (rAd-livin/MSCs group). Left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), the maximum increased rate of left ventricular pressure (-dp/dtmax) and the maximum decline rate of left ventricular pressure (+dp/dtmax) were recorded for evaluating the cardiac functions. RESULTS: The apoptosis of rAd-livin/MSCs was significantly decreased as compared with MSCs and rAd-control/MSCs (P<0.05). Meanwhile, the expression of caspase-3, caspase-7 and caspase-9 was significantly downregulated as compared with the other 2 groups (P<0.05). The cardiac function in rAd-livin/MSCs group was significantly improved as compared with DMEM group, and those in the other 2 groups got the similar results, but the function in rAd-livin/MSCs group was better improved. Meanwhile, the number of surviving cells in rAd-livin/MSCs group was significantly improved as compared with the other 2 groups. CONCLUSION: The apoptosis of MSCs is decreased after rAd-livin transfection, and the expression of caspase-3, caspase-7 and caspase-9 is also significantly downregulated while the expression of livin is significantly upregulated. Transplantation of livin-modified BM-MSCs by lentiviral vector results in better prognosis for treating myocardial infarction by enhancing cell survival.

[KEY WORDS]Livin gene; Mesenchymal stem cells; Myocardial infarction; Cardiac function

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.025

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0791-86263601； E-mail： ncwqh@163.com

*[基金項目]江西省自然科學基金資助項目(No.20122BAB205028)

[收稿日期]2015- 07- 27[修回日期] 2015- 12- 30

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0539- 05

雜志網址： http://www.cjpp.net