西藏靈菇發酵乳胞外多糖的流變學特性

陳志娜，楊希娟，師俊玲（.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 700；.青海省農林科學院，青海 西寧 80000；3.西北工業大學生命科學　學院，陜西 西安 7007）

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西藏靈菇發酵乳胞外多糖的流變學特性

陳志娜1，楊希娟2，師俊玲3,*
（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.青海省農林科學院，青海 西寧 810000；3.西北工業大學生命科學學院，陜西 西安 710072）

摘 要：以西藏靈菇發酵乳中分離純化所得胞外多糖為研究對象，對其流變學特性進行了系統研究。結果表明，該胞外多糖的水溶液表現為典型的非牛頓假塑性流體特性，且其流動行為受胞外多糖的質量濃度、pH值、溫度、離子種類和濃度的影響，具體表現為：胞外多糖溶液的黏度隨胞外多糖質量濃度的升高而增加，質量濃度越高剪切稀釋現象越明顯；pH 4.0和pH 10.0時胞外多糖溶液黏度明顯低于pH 7.0。Na＋可使胞外多糖溶液的黏度顯著增大，且Na＋濃度越高，溶液黏度越大；Ca2＋可使胞外多糖溶液的黏度明顯下降，但其下降幅度與Ca2＋濃度無關；溫度在10～85 ℃范圍內胞外多糖溶液的黏度變化很小，有很好的耐溫性。加入10 mg/mL的該胞外多糖能夠明顯增加脫脂乳的黏度。

關鍵詞：西藏靈菇；胞外多糖；流變學特性；穩態分析；動態振蕩剪切分析

引文格式：

陳志娜,楊希娟,師俊玲.西藏靈菇發酵乳胞外多糖的流變學特性[J].食品科學,2016,37(5):1-5.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605001.http://www.spkx.net.cn

CHEN Zhina,YANG Xijuan,SHI Junling.Rheological properties of exopolysaccharide produced by Tibetan kefir[J].Food Science,2016,37(5):1-5.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605001.http://www.spkx.net.cn

西藏靈菇，類似于目前很流行的開菲爾粒（kefir），是由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌多種微生物共生形成的一種不規則的粒狀混合物[1-2]，在其生長繁殖過程中可分泌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）[3]。研究發現，kefir胞外多糖具有免疫調節[4]、抗菌性[5]和抗腫瘤[6]等功能。近年來，多糖作為稠化劑、穩定劑、乳化劑在食品工業的應用越來越廣泛[7-9]，這些都歸功于其優良的流變學特性。從西藏靈菇中分離所得乳酸菌所產胞外多糖的特性，包括其結構、生理活性及理化性質等已有所報道[10-13]，但是，有關西藏靈菇菌粒復合體所產胞外多糖的特性，特別是對其流變學特性的研究尚未見報道。

本課題組在前期研究中，對西藏靈菇發酵乳中的胞外多糖進行了分離純化，分析得知其單糖組成為葡萄糖和半乳糖，整個多糖具有良好的抗氧化活性，并對2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-aminopropane)dihyrochloride，AAPH）誘導的蛋白損傷具有一定的保護作用[14]。本實驗在前期研究的基礎上，重點研究了該胞外多糖的流變學特性，考察了質量濃度、pH值、體系溫度及鹽離子對其表觀黏度的影響，研究了其對脫脂乳黏度的提升作用，以期為其在乳制品加工中的實際應用提供理論指導。

1　材料與方法

1.1菌株、材料與培養基

西藏靈菇菌株（TK01）采集于西藏，保藏于西北農林科技大學食品科學與工程學院食品生物加工與安全實驗室。

新鮮牛乳，采購于西北農林科技大學畜牧養殖場。

脫脂牛乳培養基：鮮牛乳在4 000 r/min離心10 min去脂后，每100 mL分裝于250 mL的錐形瓶中，105 ℃條件下滅菌20 min，備用。

1.2儀器與設備

ZX7M-AR1000流變儀 美國TA公司；R-210旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司；HC-3018R高速冷凍離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司；FD-1C-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；BT25S電子天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3方法

1.3.1西藏靈菇發酵乳中胞外多糖的提取

將西藏靈菇菌接種到脫脂牛乳培養基中，25 ℃靜置培養24 h后，無菌條件下濾去西藏靈菇菌，剩余的發酵液于100 ℃條件下加熱10 min，溶解黏附在細胞表面的多糖[11]，過濾后過夜醇沉。Sevag法[15]去蛋白后，冷凍干燥得到白色蓬松狀西藏靈菇胞外多糖。

1.3.2質量濃度對胞外多糖溶液流變學特性的影響

用去離子水配制質量濃度分別為5、10、20 mg/mL的胞外多糖溶液，測定不同質量濃度胞外多糖溶液的表觀黏度。測定條件為：溫度25 ℃，椎板（40 mm，1o），測定模式為穩態剪切測定，數據獲取模式為連續讀取；以剪切速率為自變量，變化范圍為1～100 s－1，掃描完成時間為10 min，變量掃描范圍設定為線性。

1.3.3體系pH值對胞外多糖溶液流變學特性的影響

用HCl或Na OH溶液調節多糖溶液（質量濃度為10 mg/mL）的pH值分別至4.0、7.0、10.0。用流變儀測定酸堿度對胞外多糖溶液表觀黏度的影響，測定條件與1.3.2節相同。

1.3.4離子種類和濃度對胞外多糖溶液流變學特性的影響

取質量濃度為10 mg/mL的胞外多糖溶液，分別加入NaCl和CaCl2，使溶液中的鈉離子和鈣離子濃度分別為0.1、0.4 mol/L。用流變儀測定鹽離子對胞外多糖溶液表觀黏度的影響，測定條件與1.3.2節相同。

1.3.5體系溫度對胞外多糖溶液流變學特性的影響

取質量濃度為10 mg/mL的多糖溶液，用流變儀測定體系溫度對胞外多糖溶液表觀黏度的影響。測定條件：椎板（40 mm，1o），測定模式為穩態剪切測定，數據獲得模式為溫度梯度升高，溫度掃描范圍為10～85 ℃，自變量為剪切速率，范圍為1～100 s－1。

1.3.6胞外多糖溶液的動態振蕩剪切實驗

用去離子水配制質量濃度分別為5、10、20 mg/mL的胞外多糖溶液，分別測定其表觀黏度在不同剪切振蕩頻率下的變化。測定條件：溫度25 ℃，椎板（40 mm，1o），測定模式為振蕩，數據獲取模式為連續讀取，以剪切振蕩頻率為自變量，范圍為（0～10 Hz），掃描完成時間為10 min。

1.3.7胞外多糖對脫脂乳流變學特性的影響

用去離子水配制質量濃度為100 mg/mL的脫脂乳溶液，將胞外多糖以10 mg/mL加入脫脂乳溶液中，同時以不添加胞外多糖的脫脂乳作對照。測定兩種脫脂乳溶液在剪切速率變化時溶液黏度的變化。測定條件為：溫度25 ℃，椎板（40 mm，1o），測定模式為穩態剪切測定，數據獲取模式為連續讀取，以剪切速率為自變量，范圍為（0～300 s－1），掃描完成時間為10 min，變量掃描范圍設定為線性。

2　結果與分析

2.1質量濃度對胞外多糖溶液流變學特性的影響

圖1　質量濃度對胞外多糖溶液表觀黏度的影響Fig.1 Effect of EPS concentration on the visco　sity of EPS solution

由圖1可知，在所用剪切速率范圍（0～100 s－1）內，胞外多糖溶 液的表觀黏度隨著胞外多糖溶液質量濃度的增大而增加。這是因為胞外多糖質量濃度的增加加強了多糖鏈之間的相互作用，部分多糖分子相互聯結，導致聚合程度增加[16]。其中，當剪切速率較低時，不同質量濃度的胞外多糖溶液均表現為典型的非牛頓流體特性：即溶液黏度隨著剪切速率的增加而減小的假塑性和剪切稀釋的流動特征。剪切速率較高時，不同質量濃度的胞外多糖溶液隨著剪切速率的增加表現為恒定的理想牛頓流體行為。這一特性與已報道的融合菌株G23胞外多糖的流動行為相似[17]。Adeli[18]和Vardhanabhuti[19]等認為，多糖鏈的取向效應導致了剪切稀釋現象的產生：剪切速率增加時，長而無序鏈的聚合物大分子的流動方向越來越趨于一致，從而使其彼此間的交互作用減弱。剪切稀釋特性在乳品加工中具有重要的意義：在攪拌過程中，隨著攪拌速率的增加，乳品的表觀黏度下降；而當攪拌速率減慢直至停止時，乳品的黏度增加[20]，這更有利于凝固性發酵乳的加工生產。

根據已有報道，理想牛頓流體行為在純溶劑或小分子物質溶液中非常普遍[21]，而多糖則因為分子質量較大以及延展構象，所以多表現出非牛頓流體的剪切稀釋現象[22]。但是也有文獻報道，一些大分子多糖也表現出牛頓流體行為[23-24]。例如，Kale等[25]對不同來源的阿拉伯木聚糖的流變學性質的研究發現，玉米麩皮多糖和switchgrass高粱麩皮多糖雖然在分子質量上差別很大，但是在高質量濃度時，兩者都沒有表現出剪切稀釋現象；同時，sumac高粱麩皮多糖和玉米麩皮多糖的分子質量雖然相近，但是它們在高質量濃度時卻表現出不一樣的流動特性。因此，聚合物流動行為的切變依賴性可能不僅與其分子質量有關，還與其精細結構和構象有關。

2.2體系pH值對胞外多糖溶液流變學特性的影響

Medina-Torres等[26]研究發現，pH值可以改變聚合物分子的構象而導致其溶液黏度發生改變。圖2顯示，溶液的pH值發生變化時，能夠顯著改變胞外多糖的表觀黏度：低pH值和高pH值都會使胞外多糖溶液的表觀黏度明顯下降。Chen等[27]研究發現，青海菜水溶性黏液的黏度在pH 5.0～9.0的范圍內，隨pH值的增大而呈現逐漸升高趨勢。他們認為，黏液中的酸性多糖基團的電荷密度會隨著pH值的增加而增多，從而促進第三電黏效應，進而導致黏液黏度的增加。Xiu Aihui等[28]對索拉膠溶液的流變學研究發現，該溶液的黏度能夠在pH 6.0～12.0的范圍內保持恒定，但是超過這一范圍的pH值都會導致其黏度下降。本實驗所得胞外多糖在pH 4.0和pH 10.0時的黏度明顯低于pH 7.0，這可能是因為該多糖在酸性或堿性環境下，導致了氫鍵斷裂，促進了多糖的分解，從而降低了其表觀黏度[29]。

圖2　pH值對胞外多糖溶液表觀黏度的影響Fig.2 Effect of pH on the viscosity of EPS solution

2.3鹽離子對胞外多糖溶液流變學特性的影響

圖3　鹽離子對胞外多糖溶液表觀黏度的影響Fig.3 Effect of salt ions on the viscosity of EPS solution

鹽離子對多糖溶液表觀黏度的影響是評價其流變學特性的重要因素。由圖3可知，離子的類型和濃度對所得胞外多糖溶液的流變學特性都會產生顯著影響。Na＋的添加會使多糖溶液的表觀黏度顯著增加；并且其黏度隨著Na＋添加濃度增大而增加。而Ca2＋的添加則會使胞外多糖溶液的表觀黏度產生明顯下降，但Ca2＋濃度的變化對其黏度的影響不大。在0.4 mol/L的Na＋和Ca2＋存在下，所得多糖溶液仍然能夠保持明顯的假塑性流體特征。

從理論分析，無機鹽離子可以通過屏蔽聚合物鏈上的帶點基團之間的靜電排斥而影響聚合電解質[30]，最終導致兩種不同的結果：分子擴張的減少引起的黏度下降和分子間的締合引起的黏度增加。本實驗結果表明，NaCl的加入減少了多糖分子的電荷，促使了可溶性分子配合物的產生，從而導致黏度增加[19]；而CaCl2的加入則導致了多糖分子的緊密構象，改變了大分子的流體力學尺寸，從而引起黏度降低[31-32]。

2.4體系溫度對胞外多糖流變學特性的影響

圖4　溫度對胞外多糖溶液表觀黏度的影響Fig.4 Effect of temperature on the viscosity of EPS solution

由圖4可知，10 mg/mL的胞外多糖溶液的表觀黏度在10～85 ℃的溫度范圍內表現為：隨著溫度升高而略有下降，但總體比較穩定。這說明，該胞外多糖溶液具有很好的熱穩定性，能夠適應不同溫度的加熱處理。根據已有報道，溫度對膠體黏度的影響與膠體的種類有關：黃原膠可以在很高的溫度范圍內保持黏度不變[33-34]，而半乳甘露聚糖的黏度隨著溫度從20 ℃到80 ℃下降50%[35]，而本實驗所用多糖的黏度能夠在一定的溫度范圍內保持相對穩定。說明其形成的膠體與已有研究報道稍微有所不同。

2.5胞外多糖溶液的動態振蕩剪切實驗結果

圖5　不同質量濃度的胞外多糖溶液的儲能模量（G’）與損耗模量（G’’）隨頻率變化規律Fig.5 Frequency dependence of storage(G’)and loss(G’’)modulus of EPS solution with different concentrations

圖5為不同質量濃度的胞外多糖溶液的動態振蕩剪切實驗結果。隨著剪切振蕩頻率的增加3 個不同質量濃度的多糖溶液的儲能模量（G’）和損耗模量（G’’）都表現出連續升高。在低頻率條件下，G’’高于G’；當頻率達到一定值時，G’’曲線與G’曲線相交，交點處頻率稱為交叉頻率，通常被定義為彈性行為或凝膠狀態的開始[36]。剪切振蕩頻率低于交叉頻率時（G’’＞G’），多糖溶液主要表現為液體黏性性質；剪切振蕩頻率高于交叉頻率時（G’’＜G’），多糖溶液主要表現為固體彈性性質[17,37]。本實驗結果表明，隨著多糖質量濃度的增加，溶液的交叉頻率有所降低，這說明隨著多糖質量濃度的增加，多糖溶液的膠體化程度增大，更多地表現為固體彈性性質。類似的結果也在其他研究中有所報道：Sengkhamparn等[37]對不同濃度的秋葵HBSS果膠水溶液的研究發現，果膠溶液的交叉頻率隨著果膠濃度的增加而降低；Gorret等[38]在P.acidipropionici產多糖溶液的流變學性質研究中也得到了相類似的結果。

2.6胞外多糖對脫脂乳溶液流變學特性的影響

圖6　胞外多糖對脫脂乳表觀黏度的影響Fig.6 Effect of EPS addition on the viscosity of skim milk

圖6為胞外多糖對脫脂乳溶液表觀黏度的影響，添加了10 mg/mL胞外多糖的脫脂乳溶液的表觀黏度顯著高于未添加胞外多糖的脫脂乳溶液。而且，兩種溶液的表觀黏度均在0～50 s－1內隨著剪切速率的增大而快速下降，表現為明顯的剪切稀釋作用。Ruas-Madiedo等[39]的研究發現，乳酸菌所產胞外多糖可以作為質地改良劑，明顯地提高乳制品的黏度，還能夠通過乳中的蛋白質膠粒相互作用而增強蛋白網絡的剛性和穩定性。本實驗所用多糖在乳液中的研究結果與此類似，說明其在乳制品中有很好的應用潛力。

3 結 論

本研究結果表明：西藏靈菇胞外多糖溶液表現為典型的非牛頓假塑性流體特性，具有很好的耐溫性，堿性或酸性條件下，其表觀黏度在會顯著下降；Na＋可以增強其表觀黏度，而Ca2＋會降低其表觀黏度。西藏靈菇胞外多糖能夠明顯增加脫脂乳的黏度，表現出很好的應用潛力。

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Rheological Properties of Exopolysaccharide Produced by Tibetan Kefir

CHEN Zhina1,YANG Xijuan2,SHI Junling3,*
(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Xining 810000,China; 3.School of Life Sciences,Northwestern Polytechnical University,Xi’an 710072,China)

Abstract:In this study,the rheological properties of exopolysaccharide(EPS)produced by Tibetan kefir were evaluated.The results showed that the aqueous EPS solution was a typical non-Newtonian pseudoplastic fluid,and its flow behavior was affected by concentration,pH,temperature,cation type and concentration.Specifically,the viscosity of EPS solution increased with its increasing concentration and the shear thinning phenomenon was more obvious.The viscosity of EPS solution at pH 10.0 or pH 4.0 was obviously lower than that at pH 7.0.The addition of Na+significantly increased the viscosity of EPS solution in a concentration-dependent fashion.However,the viscosity of EPS solution was greatly decreased when Ca2+was added.The viscosity of EPS solution little changed with good temperature resistance at 10–85 ℃.The viscosity of skim milk was significantly increased by adding 10 mg/mL of the EPS.

Key words:Tibetan kefir; exopolysaccharide; rheological properties; steady-state analysis; dynamic oscillatory shear analysis

中圖分類號：TS252.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0001-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605001

*通信作者：師俊玲（1972—），女，教授，博士，主要從事食品生物技術研究。E-mail：sjlshi2004@aliyun.com

作者簡介：陳志娜（1988—），女，博士研究生，主要從事食品生物技術研究。E-mail：chenzhina0625@163.com

基金項目：國家自然科學基金地區科學基金項目（31260395）

收稿日期：2015-04-16