添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白結構及膜性能的影響

張慧蕓，吳靜娟，段 續（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

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添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白結構及膜性能的影響

張慧蕓，吳靜娟，段 續
（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

摘 要：研究不同添加量（1%、2%、3%、4%、5%）多酚化合物（阿魏酸、鞣酸、迷迭香酸和丁香酸）對鯉魚肌原纖維蛋白結構和膜特性的影響。結果表明，與丁香酸、迷迭香酸和阿魏酸相比，添加鞣酸的蛋白成膜液中自由氨基和巰基含量最低，表明鞣酸具有較高的蛋白交聯能力（P＜0.05）。隨著多酚添加量的增加，膜的彈性和拉伸強度逐漸增強，斷裂伸長率逐漸降低（P＜0.05），表明添加多酚化合物提高了膜的硬度和強度。在相同質量分數條件下，添加鞣酸的鯉魚肌原纖維蛋白膜具有最高的彈性和拉伸強度。添加多酚化合物有效降低了鯉魚肌原纖維蛋白膜的紫外和可見光透過率，降低程度取決于多酚的種類和濃度。添加多酚化合物的鯉魚肌原纖維蛋白膜可用于高脂食品的內包裝，防止食品脂質氧化、延長貨架期。

關鍵詞：多酚；肌原纖維蛋白；結構；膜；性能

引文格式：

張慧蕓,吳靜娟,段續.添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白結構及膜性能的影響[J].食品科學,2016,37(5):35-40.

ZHANG Huiyun,WU Jingjuan,DUAN Xu.Effect of polyphenolic compounds on protein structure and film properties of common carp myofibrillar protein[J].Food Science,2016,37(5):35-40.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605007.http://www.spkx.net.cn

可食性膜是以天然可食性物質為原料，通過不同分子間相互作用形成的具有多孔網絡結構的薄膜，可作為食品成分直接食用。隨著現代食品技術的發展和對綠色食品的推崇，可食性膜已成為食品保鮮與包裝領域研究的熱點[1]。與多糖和脂質膜相比 ，蛋白膜具有更廣泛的功能特性，特別是具有更高的分子間結合潛力[2]。蛋白膜的性質是由其微觀結構決定的，蛋白質結構和多肽鏈分子間相互作用顯著影響蛋白膜的微觀結構[3]。由于蛋白膜可選擇性阻隔水分轉移、氧氣透過、紫外和可見光透過和揮發性芳香物質的損失，用于包裝可延長食品貨架期，維持食品貯藏期間品質[4-5]，目前已被應用于堅果或焙烤食品的涂布膜[6]。

已有研究表明魚肉肌原纖維蛋白和肌漿蛋白可被用作成膜材料。如Chinabhark等[7]采用0.02 g/mL大眼鯛魚肌原纖維蛋白添加50%甘油塑化制備可食性蛋白膜，發現膜具有較高的拉伸強度和斷裂伸長率。我國是一個漁業大國，淡水魚類是我國居民食物的重要組成部分，是主要的動物蛋白質來源之一。鯉魚是中國分布最廣、養殖歷史最悠久的淡水經濟魚類。適當開發來自鯉魚肉的肌原纖維蛋白，獲得具有營養和生物可降解性的食品包裝膜具有一定的應用前景。但是，當蛋白膜暴露于潮濕條件下其機械性能相對較差，且與脂質膜相比成本較高，限制了其作為食品包裝的應用[8-9]。因此需要對蛋白質進行結構改性以提高其機械強度和阻水性，可采用化學、物理和酶法改性[10]，改善蛋白膜的性能。研究表明，不同來源的酚類化合物可與蛋白質發生相互作用或反應，使明膠材料的凝膠或膜性能得到改善[11]。多酚可在氧化條件下與肽的氨基側鏈反應形成蛋白交聯[12]。阿魏酸可通過產生共振穩定的自由基中間體與蛋白質和多糖交聯[13]。氧化阿魏酸可與蛋白質中的氨基和硫醇基反應[14]。而且，阿魏酸自身反應形成的二阿魏酸可作為蛋白分子之間的連接橋梁[15]。鞣酸也具有結合蛋白質的能力[16]。與其他交互作用相比，酚類化合物和蛋白質共價鍵產生的共價交聯作用更強，熱穩定性更好。但是，關于酚類化合物對魚肌原纖維蛋白結構及其膜性能影響的報道甚少。本實驗以鯉魚肌原纖維蛋白為原料，甘油為增塑劑，添加具有蛋白交聯作用的幾種多酚化合物（阿魏酸、鞣酸、迷迭香酸和丁香酸），制備鯉魚肌原纖維蛋白-多酚復合可食性膜，主要研究多酚添加對肌原纖維蛋白結構及膜物理和機械 性能的影響，以期為開發應用新型可食包裝技術提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鮮活鯉魚購于洛陽市大張盛德美超市。

三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS）、5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美國Sigma公司；迷迭香酸、丁香酸、阿魏酸（純度＞98%） 上海純優生物科技有限公司；鞣酸（純度＞99%） 河北百味生物科技有限公司；亞硫酸鈉、溴化鈉 天津博迪化工有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

DHG-9003型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；UV-754型紫外-可見光分光光度計上海光譜儀器有限公司；TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司；CS-32l便攜式色差儀 日本美能達公司。

1.3方法

1.3.1鯉魚肌原纖維蛋白的提取

鯉魚肌原纖維蛋白提取參照Chin[15]和Jiang Xinjing[17]等的方法并適當修改，提取液采用20 mmol/L、pH 7.5的磷酸鹽緩沖液，漂洗液采用0.1 mol/L NaCl。提取過程在4 ℃條件下操作。

1.3.2鯉魚肌原纖維蛋白成膜液的制備

參考Shiku等[18]的方法，略有修改。配制0.015 g/mL的魚肌原纖維蛋白溶液，攪拌15 min使其充分溶解，冷卻后加入50%的甘油，室溫下攪拌30 min。用1 mol/L NaOH調節溶液pH值為11，分別添加0（對照組）、1%、2%、3%、4%和5%的迷迭香酸、丁香酸、阿魏酸和鞣酸，室溫下連續充氧攪拌1 h使部分多酚化合物氧化為醌，醌可在堿性條件下與蛋白質氨基發生反應[13-14]。得到成膜液用于分析及干燥成膜。

1.3.3添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白結構的影響

1.3.3.1自由氨基含量的測定

參考Lertittikul等[19]的方法進行自由氨基含量的測定。取125 μL適當稀釋的樣品與2.0 mL 0.212 5 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 8）充分混合，加入1.0 mL質量分數0.01%的三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS）溶液。混合液放入50 ℃水浴中避光保持30 min后，加入2.0 mL 0.1 mol/L亞硫酸鈉終止反應。將混合物放于室溫下冷卻15 min后，采用分光光度計測定其420 nm波長處的吸光度。自由氨基含量根據L-亮氨酸標準曲線計算得出，單位為mmol/L。

1.3.3.2總巰基含量的測定

參考Beveridge等[20]的方法測定成膜液的總巰基含量。取1.0 mL樣品成膜液加入9 mL鹽酸胍磷酸緩沖液（鹽酸胍6 mol/L，PBS 0.1 mol/L，pH 8.0），取4 mL上述混合液加入0.4 mL 質量分數0.1% DTNB ，45 ℃保溫，反應25 min，采用分光光度計測定其412 nm波長處的吸光度。巰基含量用摩爾吸光系數13 600 L/（mol·cm）計算，表示為每克蛋白質所含的摩爾數。

1.3.4鯉魚肌原纖維蛋白膜的制備

將4 g成膜液倒入有機玻璃板（5 cm×5 cm）中，在60 ℃的干燥箱中干燥3 h成膜。之后在裝有飽和NaBr溶液的干燥器中（相對濕度56%，20 ℃）平衡48 h，待測。

1.3.5添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白膜性能的影響

1.3.5.1膜機械性能的測定

參考Yin等[21]的方法，采用質構儀TA-XT2i測定膜的彈性模量（E）、拉伸強度（tensile strength，TS）和斷裂伸長率（elongation at break，EAB），每種膜測定5 個樣品，每個樣品尺寸為2 cm×5 cm。質構分析儀初設夾距為50 mm，拉伸速率設為30 mm/min。樣品測試前在25 ℃、50%相對濕度條件下平衡2 d。彈性模量由膜應力應變圖的初始斜率測得，拉伸強度和斷裂伸長率按下式計算。

式中：Fmax為最大拉力/N；L為膜樣品的厚度/mm；W為膜樣品的寬度/mm。

式中：L1為膜斷裂后的長度/mm；L0為膜斷裂前的長度/mm。

1.3.5.2顏色值的測定[22]

使用便攜式色差計對其進行測定，參照CIELAB系統表示復合膜的顏色。將膜樣品平放在白色校正板上，校正板型號CR-A43，其中L*＝94.0，a*＝0.313，b*＝0.319，測試記錄＋L*值為亮色方向，－L*值為暗色方向、＋a*值為紅色方向，－a*值為綠色方向、＋b*值為黃色方向，－b*值為藍色方向以及ΔE值。每個樣品選擇5 個點進行測量，一個點從中央選取，另外沿著膜四周取4 個點，取平均值。

1.3.5.3透光率的測定

參考Shiku等[23]的方法，用紫外-可見分光光度計測定膜在200～800 nm波長范圍內的透光率，每個樣品重復測定3 次，取平均值。

1.4數據分析

所得數據均為3 次重復的平均值，用Statistix 8（分析軟件,St Paul,MN）進行數據分析，平均數之間差異顯著性（P＜0.05）通過最小顯著差值（least s ignificant difference，LSD）進行判斷，用Sigmaplot 9.0軟件作圖。

2　結果與分析

2.1添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白成膜液中自由氨基含量的影響

添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白自由氨基含量的影響如圖1所示。添加多酚的成膜液與對照組相比自由氨基含量較低（P＜0.05），且隨著多酚添加量的增加，成膜液中自由氨基含量顯著降低（P＜0.05）。這是由于蛋白質氨基酸的α-或ε-NH2可與酚類化合物產生共價交聯作用，在較大范圍內形成了酚-蛋白復合物，尤其在較高濃度酚類化合物的情況下，酚類化合物的氧化產物——醌具有較強的攻擊氨基活性[13-14]。與丁香酸、迷迭香酸和阿魏酸相比，添加鞣酸的蛋白成膜液中自由氨基含量最低，表明鞣酸具有較高的蛋白交聯能力（P＜0.05）。這是由于鞣酸中羥基含量較高，羥基可被轉化為具有交聯作用的醌[14,24]，此外，剩余羥基可通過弱鍵與氨基相互作用[25]。Prigent[26]報道了酚類化合物的羥基與氨基酸的氮或氧的相互作用，酚類化合物和氨基酸之間亦可發生疏水相互作用。

圖1　添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白自由氨基含量的影響Fig.1 Free amino group contents of film-forming solutions(FFS)containing fish myofibrillar proteins added with various phenolic compounds at different concentrations

2.2添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白成膜液中總巰基含量的影響

圖2　添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白總巰基含量的影響Fig.2 Sulfhydryl group contents of film-forming solutions(FFS)containing fish myofibrillar proteins added with various phenolic compounds at different concentrations

添加多酚化合物對鯉魚肌原纖維蛋白總巰基含量的影響如圖2所示。與對照組相比，添加多酚化合物的成膜液具有較低的巰基含量（P＜0.05）。多酚的添加可能會引起蛋白質巰基和多酚羥基之間的相互作用，形成更好的構造。巰基含量的降低可能是由于添加多酚提高了巰基氧化為二硫鍵的程度[26]。而且，多酚氧化產物——醌類化合物亦可直接與巰基相互作用[14]，導致巰基被醌類化合物掩蔽。咖啡酸和鞣酸在不同濃度水平下均引起巰基含量的較大降低。添加多酚化合物有助于魚肌原纖維蛋白膜二硫鍵的形成，提高了膜的強度與剛度。

2.3添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白膜機械性能的影響

不同添加量的多酚對鯉魚肌原纖維蛋白膜彈性、拉伸強度和斷裂伸長率的影響見圖3。如圖3A所示，隨著多酚添加量的增加，膜的彈性均顯著增強（P＜0.05）。對照組膜的彈性值最低，為153.45 MPa，添加1%阿魏酸的蛋白膜彈性值與對照組差異不顯著（P＞0.05）。如圖3B所示，隨著多酚添加量的增加，膜的拉伸強度也逐漸增加（P＜0.05），添加3%～5%的迷迭香酸和丁香酸時膜的拉伸強度增加不再顯著（P＞0.05）。膜的強度和剛度增加是由于氧化酚類增強了蛋白膜中非二硫共價鍵與二硫鍵及非共價鍵之間的交聯作用，表1中蛋白成膜液自由氨基和巰基含量的降低也證實了這一點。

如圖3C所示，添加1%～5%的多酚降低了膜的斷裂伸長率（P＜0.05），添加3%～5%迷迭香酸對膜斷裂伸長率的影響差異不再顯著（P＞0.05）。多酚的添加增強了膜蛋白鏈的相互作用，使膜的強度和硬度增加，延展性降低，這是由于在堿性條件下酚類化合物可被氧化為醌，醌可作為蛋白交聯劑與蛋白質分子的親核性氨基或巰基側鏈反應形成C—N或C—S共價鍵[14]，還可引起蛋白質之間形成非二硫共價鍵，導致蛋白質分子之間的相互連接更加緊密，改善膜的彈性和拉伸強度。此外，多酚化合物的羥基可通過氫鍵與蛋白質分子的氫受體結合。Rattaya等[9]報道了添加海藻提取物的膠原蛋白膜機械性能增強主要是由于蛋白質和多酚之間的疏水作用和氫鍵結合力作用。

在相同添加量條件下，添加鞣酸的蛋白膜具有最高的彈性和拉伸強度，其次是迷迭香酸、丁香酸和阿魏酸。這可能是由于與其他多酚化合物相比，鞣酸對肌原纖維蛋白具有更大的交聯能力，蛋白成膜液的自由氨基含量測定結果也證實了這一點。這表明不同結構的酚類化合物與蛋白質的相互作用不同。添加羥基含量高的多酚化合物有利于蛋白質-多酚之間氫鍵的形成和膜網絡結構的改善[13-14]。Cao Na等[11]報道了向堿性膠原蛋白成膜液中添加阿魏酸和鞣酸使膜的拉伸強度顯著增加；Friesen等[27]報道了向堿性大豆分離蛋白成膜液中添加阿魏酸使膜的拉伸強度顯著增加。

圖3　添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白膜彈性（A）、拉伸強度（BB）和斷裂伸長率（CC）的影響Fig.3 Young’s modulus(A),tensile properties(B)and elongation(C)at break of fish myofibrillar protein films incorporated with various phenolic compounds

2.4添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白膜顏色值的影響

表1　添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白膜顏色的影響Table 1 Color parameters of fish myofibrillar protein films added with various phenolic compounds at different concentrations

不同添加量多酚化合物對鯉魚肌原纖維蛋白膜顏色值的影響如表1所示。隨著多酚添加量的增加，膜顏色強度增加。與對照組相比，添加1%～5%多酚化合物使膜的L*值降低，a*值和b*值升高（P＜0.05）。添加4%和5%阿魏酸的蛋白膜L*值差異不顯著（P＞0.05）。添加多酚化合物的種類和濃度極大影響了鯉魚肌原纖維蛋白膜的顏色，這是由不同酚類化合物的色素含量、類型及化學組成不同引起的。Rattaya等[9]報道了向膠原蛋白膜中添加海藻提取物引起膜顏色的變化是由于海藻提取物中色素的影響。Nuthong等[28]報道了添加氧化咖啡酸使豬血漿蛋白膜的b*值增加。

2.5添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白膜透光率的影響

表2　添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白膜透光率的影響Table 2 Light transmittance of fish myofibrillar protein films added with various phenolic compounds at different concentrations %

添加多酚對鯉魚肌原纖維蛋白膜紫外光和可見光透光率的影響如表2所示。在200～280 nm波長范圍內，添加不同多酚化合物均降低了膜的紫外光透過率。多酚添加量較高的蛋白膜具有較低的紫外光透過率。由于紫外光可使食品產生有害變化特別是脂質氧化，因此膜透光率的降低對食品保藏是有利的。在可見光范圍（350～800 nm）內，對照膜的透光率為80%～90%，添加多酚化合物導致膜的透光率降低。膜的光學特性是膜的重要屬性，影響產品的外觀、適銷性及應用性[5]，透明度高的可食性膜在食品包裝系統中具有較高的應用性和可接受性。隨著多酚化合物添加量的增加，膜的可見光透過率降低。這是由于較高濃度的多酚化合物具有較高的阻光性，導致膜在可見光范圍內具有有限的透光率。多酚對膜可見光透過性的影響取決于多酚的種類、多酚在膜基質中的含量和分布，具有不同透光率的膜基質形態亦不同。

3　結 論

添加多酚化合物可有效加強鯉魚肌原纖維蛋白的交聯或相互作用，改善鯉魚肌原纖維蛋白膜的性能，提高膜的硬度和強度。由于鞣酸具有較高的蛋白交聯效率，添加鞣酸的膜具有較高的拉伸強度。添加多酚化合物可對膜的顏色和透光率產生影響，在紫外和可見光范圍內，添加多酚化合物增加了膜的阻光性，有利于防止包裝食品的脂質氧化。因此可通過選擇性添加酚類化合物改善鯉魚肌原纖維蛋白膜的物理和機械特性。

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Effect of Polyphenolic Compounds on Protein Structure and Film Properties of Common Carp Myofibrillar Protein

ZHANG Huiyun,WU Jingjuan,DUAN Xu
(College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)

Abstract:The objective of this study was to investigate the effects of several polyphenolic compounds(ferullic acid,tannic acid,rosmarinic acid and syringic acid)at various concentrations(1%,2%,3%,4% and 5% based on protein)on structure and properties of fi lm from myofi brillar protein of common carp(Cyprinus carpio).Among all the investigated polyphenolic compounds,tannic acid showed the highest cross-linking capacity on myofi brillar protein as evidenced by in the lowest free amino group and sulfhydryl group contents in the fi lm-forming protein solution.The addition of polyphenolic compounds could enhance mechanical properties of the resulting films.With increasing concentration of polyphenolic compounds added,Young’s modulus(E)and tensile strength(TS)of the fi lms increased,while their elongation at break(EAB)decreased (P<0.05),suggesting stronger and stiffer fi lm structure.At the same concentration used,tannic acid could result in higher mechanical properties(elasticity and tensile strength)of the fi lm when compared with other polyphenolic compounds.The transparency and color of the film were reduced by polyphenolic compounds,depending on the type and concentration.Therefore,polyphenolic compounds can potentially be applied in inner packaging materials for high-fat foods to prevent lipid oxidation,thus prolonging the shelf-life of foods during storage.

Key words:polyphenolic compounds; myofi brillar proteins; structure; fi lm; properties

中圖分類號：TS201.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0035-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605007 10.7506/spkx1002-6630-201605007.http://www.spkx.net.cn

作者簡介：張慧蕓（1977—），女，副教授，博士，主要從事天然產物活性研究。E-mail：zhanghuiyun21@163.com

基金項目：河南人才培養聯合基金項目（C2003）

收稿日期：2015-03-30