酶解法制備草魚皮蛋白水解物增殖嗜熱鏈球菌

陳建康，包建強（上海海洋大學食品學院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

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酶解法制備草魚皮蛋白水解物增殖嗜熱鏈球菌

陳建康，包建強*
（上海海洋大學食品學院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

摘 要：嗜熱鏈球菌被認為是一種多功能益生菌，將Neutrase 0.8L、Protease P “Amano”6、ProteAX、Alcalase 2.4L FG和風味中性蛋白酶5 種草魚皮蛋白水解物作為培養(yǎng)嗜熱鏈球菌的氮源，以水解物對嗜熱鏈球菌的增殖效果為評價指標，選擇最佳水解用酶，并利用正交試驗優(yōu)化酶解條件。結(jié)果表明，5 種微生物蛋白酶中，Neutrase 0.8L是水解草魚皮蛋白的最佳用酶，最佳的酶解條件為：加酶量1%、酶解時間80 min、起始pH 6.5、料水比1∶2（m/V）。利用Neutrase 0.8L酶解法制備得到的富含膠原蛋白肽的草魚皮蛋白水解物，是一種培養(yǎng)嗜熱鏈球菌的理想氮源。

關(guān)鍵詞：草魚皮；蛋白酶；酶解；膠原蛋白肽；嗜熱鏈球菌

引文格式：

陳建康,包建強.酶解法制備草魚皮蛋白水解物增殖嗜熱鏈球菌[J].食品科學,2016,37(5):144-148.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605026.http://www.spkx.net.cn

CHEN Jiankang,BAO Jianqiang.Enzymatic preparation of protein hydrolysate from grass carp skin for use as a nitrogen source for Streptococcus thermophilus growth[J].Food Science,2016,37(5):144-148.(in Chinese with English abstract)

在資源、環(huán)境和可持續(xù)發(fā)展面臨的問題日益嚴峻的今天，作為可再生資源的膠原，備受人們的關(guān)注[1]。水產(chǎn)動物膠原蛋白在低過敏性、低抗原性、低熱變性和酶解較容易等方面明顯優(yōu)于陸生動物膠原蛋白[2]。魚類加工過程中產(chǎn)生的大量富含Ⅰ型膠原的魚皮、魚骨和魚鱗等副產(chǎn)物是魚類膠原蛋白或明膠的重要來源[3-4]。這些副產(chǎn)物含有的蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的氨基酸平衡和蘊含生物活性肽序列[5]。活性肽序列的釋放主要有體外酶法、食品加工、體內(nèi)消化和發(fā)酵水解4 種途徑[6]，其中酶解法具有反應條件溫和、減少環(huán)境不良影響、增加水解專一性、優(yōu)異的產(chǎn)品質(zhì)量和功能特性等諸多優(yōu)點，成為水產(chǎn)品加工業(yè)發(fā)展的重要趨勢[5,7-10]。酶解法制備得到的水產(chǎn)膠原蛋白肽具有抗氧化、抗高血壓、抗疲勞、抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇及降血脂等生物活性，可作為功能性食品添加劑用于消化道健康和調(diào)整腸道營養(yǎng)吸收[5,7,10-12]。

嗜熱鏈球菌被認為是一種多功能益生菌，與瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和乳鏈球菌相比較，其蛋白水解能力最弱[13]。嗜熱鏈球菌體內(nèi)蛋白酶的活性通常較弱，甚至缺乏必要的蛋白酶，從酸奶中分離得到的嗜熱鏈球菌不能水解明膠進一步證實其最適培養(yǎng)氮源是蛋白水解物[14-15]。因此，本實驗擬利用酶工程技術(shù)，以草魚皮為利用對象，選擇適宜的蛋白酶，通過正交試驗確定最佳酶解工藝參數(shù)，酶解制備促進嗜熱鏈球菌增殖的富含膠原蛋白肽的草魚皮蛋白水解物，以期為魚類膠原蛋白肽應用于人類的微生態(tài)領(lǐng)域提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

草魚皮由浙江湖州南潯新雅農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供。

草魚皮酸溶性膠原蛋白 由食品專業(yè)加工保鮮實驗室自制；Alcalase 2.4L FG（Bacillus licheniformis）、Neutrase 0.8L（Bacillus amyloliquefaciens） 丹麥諾維信（中國）投資有限公司； Protease P “Amano”6 （Aspergillus melleus）、ProteAX（Aspergillus oryzae）日本天野酶制品株式會社；風味中性蛋白酶（Aspergillus oryzae） 山東隆大生物工程有限公司；酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌） 北京川秀科技有限公司；其余為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2儀器與設備

TG16-WS臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜儀（配有Waters 2996二極管陣列檢測器及Empower2色譜軟件） 美國Waters公司；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；ZQLY-300振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3方法

1.3.1草魚皮成分的分析

水分含量：GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；蛋白質(zhì)含量：GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪含量：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》；灰分含量：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；總糖含量：GB/T 5009.8—2008 《食品中蔗糖的測定》。

1.3.2草魚皮膠原蛋白肽的制備

制備流程：草魚皮切碎物→清洗→加水混勻→調(diào)節(jié)pH值→熱處理→冷卻至酶解溫度→加酶→酶解→滅酶→冷卻→離心過濾、除脂→凍干→粉狀膠原蛋白肽。

在制備過程中，考慮到草魚蛋白分離后的肌球蛋白、肌動蛋白、肌漿蛋白及膠原蛋白的變性溫度分別為50.92、74.09、59.94、59.75 ℃[16]，同時避免酶解過程中的微生物污染和提高原料蛋白的酶解敏感性，故采用100 ℃、10 min熱處理；另外，為了避免最終產(chǎn)物中的灰分含量過高，酶解過程的pH值不外加堿進行控制[17]。

1.3.3酶解產(chǎn)物的游離氨基酸測定

磺基水楊酸法：稱取2 g樣品，加入0.02 mol/L的鹽酸溶液15 mL，充分均質(zhì)后用0.02 mol/L的鹽酸溶液定容至50 mL，在5 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL加入8 g/100 mL磺基水楊酸溶液2 mL，在4 ℃冰箱里靜置放置30 min后，在10 000 r/min離心10 min。取上清液，過0.22 μm濾膜后，進樣測定（根據(jù)樣品中氨基酸濃度進行適當稀釋）。進樣量為20 μL。

1.3.4草魚皮膠原蛋白肽促進嗜熱鏈球菌生長活性的測定

1.3.4.1嗜熱鏈球菌的分離制備[18]

利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最適pH值分別為5.0和9.0，將兩者有效分離。

1.3.4.2嗜熱鏈球菌增殖培養(yǎng)基的配制[19]

化學限定培養(yǎng)基組成（g/L）：葡萄糖20.0、草魚蛋白水解物（多肽和氨基酸添加總量）1.51、乙酸鈉4.0、檸檬酸三銨1.0、磷酸二氫鉀2.0、磷酸氫二鉀2.0、硫酸鎂0.5、硫酸錳0.05、硫酸亞鐵0.02、氯化鈣0.2、肌醇0.002、對氨基苯甲酸0.000 5、葉酸0.000 5、尼克酸0.002、泛酸鈣0.002、生物素0.001、吡哆醇0.002、核黃素0.002、鈷胺素0.001、硫胺素0.001、吐溫-80 1.0。

配制過程中，維生素和無機鹽用0.22 μm濾膜過濾除菌，其余溶解后115 ℃滅菌20 min。臨用時再按比例混合。

1.3.4.3嗜熱鏈球菌的增殖培養(yǎng)

10 mL嗜熱鏈球菌活化試管斜面加入5 mL滅菌蒸餾水，用無菌竹簽刮下菌苔，振勻制備菌懸液；250 mL三角瓶裝液量為30 mL，接種量為0.3 mL菌懸液；42 ℃培養(yǎng)40 h；培養(yǎng)過程搖床轉(zhuǎn)速100 r/min。

1.3.4.4嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液中嗜熱鏈球菌增殖效果的測定

以蒸餾水為調(diào)零基準，在波長為600 nm處進行測定嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液的OD600 nm值。以OD600 nm值表示嗜熱鏈球菌的增殖效果。

1.3.5草魚皮蛋白質(zhì)、酸溶性膠原蛋白和草魚皮蛋白水解物氨基酸組成的測定

按照GB/T 5009.124—2003 《食品中氨基酸的測定》方法測定。

1.3.6 不同蛋白酶對草魚皮蛋白的酶解條件

表1　5 種蛋白酶對草魚皮蛋白的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of five proteases for grass carp skin protein

1.3.7Neutrase 0.8L酶解單因素試驗

由于Neutrase 0.8L中性蛋白酶的最適工作條件為：溫度45～55 ℃之間，pH 5.5～7.5，因此單因素試驗僅考察料水比、加酶量和酶解時間。

1.3.7.1料水比對酶解物促進嗜熱鏈球菌增殖的影響

在50 ℃、起始pH 7.0、加酶量（以新鮮魚皮計，下同）為2.0%、酶解時間為100 min的條件下，研究料水比（m/V）分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4對酶解物促進嗜熱鏈球菌增殖的影響。

1.3.7.2加酶量和酶解時間對酶解物促進嗜熱鏈球菌增殖的影響

在料水比1∶2、酶解溫度50 ℃、起始pH 7.0的條件下，研究加酶量分別為0.5%、1.0%、2.0%、 3.0%，酶解時間分別為60、80、100、120 min對酶解物促進嗜熱鏈球菌增殖的影響。

1.3.8Neutrase 0.8L酶解條件正交試驗

在單因素多水平分析的基礎上，以酶解物促進嗜熱鏈球菌增殖效果（OD600 nm）為指標，以起始pH值、酶解時間、料水比和加酶量為因素，通過L9（34）正交試驗對影響蛋白酶Neutrase 0.8L水解的反應參數(shù)進行優(yōu)化。

2　結(jié)果與分析

2.1草魚皮基本成分

表2　草魚魚皮的基本成分Table 2 Proximate composition of grass carp skin

由表2可知，草魚魚皮具有高蛋白、低脂、低灰分、低糖的特點。檢測結(jié)果與傅燕鳳等[20]研究結(jié)果基本一致。本實驗用魚皮原料脂肪干基含量為5.8%，相對較低，比Wasswa[21]報道的20.1%和林琳[22]報道的20.2%低，而比張艷等[23]報道的1.9%和郭文宇等[24]報道的1.3%高。魚皮原料的來源及其質(zhì)量決定了本實驗在酶解前省略去除脂肪的步驟。

2.2不同蛋白酶對草魚皮蛋白的分解能力

從表3嗜熱鏈球菌的OD600 nm值可知，草魚皮蛋白水解物促進嗜熱鏈球菌增殖效果最好的是Neutrase 0.8L，其次為風味中性蛋白酶、ProteAX、Alcalase 2.4L FG和Protease P “Amano”6。

2.3酶解產(chǎn)物游離氨基酸含量分析

表4　5 種酶　解產(chǎn)物游離氨基酸含量Table 4 Free amino acid contents of five enzymatic hydrolysates %

由表4可知，Alcalase 2.4L FG和Neutrase 0.8L蛋白酶水解產(chǎn)生的游離氨基酸生成率明顯低于風味中性蛋白酶、ProteAX和Protease P“Amano”6。Letorc[25]報道了大多數(shù)嗜熱鏈球菌的生長都需要蛋氨酸、組氨酸、脯氨酸以及谷氨酸。由表4可知，風味中性蛋白酶、ProteAX和Protease P“Amano”6這3 種酶解產(chǎn)物游離谷氨酸、組氨酸和蛋氨酸含量明顯比Neutrase 0.8L 和Alcalase 2.4L這兩種酶解產(chǎn)物的相應游離氨基酸高，而且Neutrase 0.8L的游離谷氨酸含量最低，但是Neutrase 0.8L酶解產(chǎn)物促進嗜熱鏈球菌增殖的效果最好，因此，酶解產(chǎn)物中游離氨基酸的數(shù)量并非是其促進嗜熱鏈球菌增殖效果的決定因素。本實驗側(cè)面驗證了白鳳翎等[19]結(jié)果：乳酸菌生長的最佳氮源是寡肽而不是氨基酸。

2.4 Neutrase 0.8L酶解單因素試驗

2.4.1料水比對酶解物促進嗜熱鏈球菌增殖的影響

圖1　料水比對酶解物促進嗜熱鏈球菌增殖的影響Fig.1 Effect of ratio between fish skin and water on the proliferation of Streptococcus thermophilus cultured using hydrolysate as nitrogen source

由圖1可知，當料水比從1∶1降至1∶2時，酶解物作為氮源得到的嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液OD600 nm值上升，當料水比繼續(xù)降至1∶3后，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液OD600 nm值有所下降，說明隨著水量的增加，先有利于酶和魚皮蛋白底物充分接觸，促進寡肽的生成；隨著水量的進一步增加，酶和魚皮蛋白在水中的濃度降低，不利于酶促反應，降低了寡肽的生成率。

2.4.2加酶量和酶解時間對酶解物促進嗜熱鏈球菌增殖的影響

圖2　加酶量和酶解時間對酶解物促進嗜熱鏈球菌增殖的影響Fig.2 Effect of Neutrase concentration and hydrolysis time on the proliferation of Streptococcus thermophilus cultured using hydrolysate as nitrogen source

由圖2可知，加酶量1.0%時得到的酶解物作為氮源時，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液OD600 nm值都是最高的，其次是加酶量3.0%，然后2.0%，最后是0.5%；同時，在酶解時間80 min內(nèi)，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液OD600 nm值上升；之后，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液OD600 nm值下降。說明在低加酶量以及較短的酶解時間內(nèi)，加酶量的增加和酶解時間的延長可促進魚皮蛋白水解生成寡肽，然而酶過量和酶解時間過長會促進寡肽進一步生成氨基酸，導致嗜熱鏈球菌培養(yǎng)液OD600 nm值下降。加酶量3.0%對應的OD600 nm值略高于加酶量2.0%對應的OD600 nm值，說明隨著加酶量的進一步增加，二者寡肽處于相同較低水平時，氨基酸促進嗜熱鏈球菌增殖的作用逐步顯現(xiàn)。

2.5Neutrase 0.8L酶解條件正交試驗

表5　Neutrase 0.8L酶解條件正交試驗方案及結(jié)果Table 5 Orthogonal array design with experimental results

從表5極差R分析影響酶解物對嗜熱鏈球菌增殖效果的各因素主次順序為：加酶量＞酶解時間＞起始pH值＞料水比。酶解條件最佳組合為A1B1C1D1，即加酶量1%、酶解時間80 min、起始pH 6.5、料水比1∶2。

2.6草魚皮蛋白質(zhì)、酸溶性膠原蛋白和Neutrase 0.8L酶解產(chǎn)物的氨基酸組成分析

表6　草魚皮蛋白質(zhì)、酸溶性膠原蛋白和Neutrase 0.8L酶解產(chǎn)物的氨基酸組成分析,Table 6 Amino acid composition of native grass carp skin protein,acid-soluble collagen and Neutrase 0.8L hydrolysate %

由表6可知，草魚皮酸溶性膠原蛋白的氨基酸中除甘氨酸、丙氨酸、組氨酸、精氨酸和半胱氨酸含量比草魚皮蛋白中相應的氨基酸含量略高外，其余的氨基酸含量略低，二者的氨基酸組成基本相當。酶解制備草魚皮蛋白水解物的實質(zhì)就是制備膠原蛋白肽的過程。

Neutrase 0.8L制備得到的草魚皮蛋白水解物的氨基酸組成與草魚皮蛋白的氨基酸組成略有差異。其中，疏水性大分子氨基酸Leu、Ile、Phe的含量較草魚皮中的對應值分別減少了6.4%、11.0%和9.2%，與中性蛋白酶的優(yōu)先切點為疏水性大分子氨基酸Leu、Ile、Phe相符合。另外，Met和Tyr分別減少了11.4%和22.2%，而His、Arg 和Ala分別增加了19.1%、4.2%和2.6%。結(jié)合表5中游離氨基酸分析結(jié)果，Neutrase 0.8L草魚皮蛋白水解物是以肽為主，游離氨基酸為次要組成部分的混合物。

草魚皮蛋白中膠原蛋白含量約占總蛋白的86%[20]，其他蛋白質(zhì)，包括彈性蛋白、白蛋白、球蛋白和粘蛋白可溶性蛋白等約占14%，以草魚皮為原料，省略提取膠原蛋白或明膠步驟，利用Neutrase 0.8L酶解制備草魚皮蛋白水解物，不僅可以提高原料蛋白的利用率，而且含有寡肽和氨基酸的蛋白水解物對嗜熱鏈球菌增殖具有促進作用，是一種培養(yǎng)嗜熱鏈球菌的理想氮源。

3　結(jié) 論

通過比較Neutrase 0.8L、Protease P“Amano”6、ProteAX、Alcalase 2.4L FG和風味中性蛋白酶5 種微生物蛋白酶草魚皮蛋白水解物對嗜熱鏈球菌的增殖效果，篩選得到最佳水解用酶為中性蛋白酶Neutrase 0.8L，并且利用正交試驗確定了其最佳酶解條件為加酶量1%、酶解時間80 min、起始pH 6.5、料水比1∶2。利用中性蛋白酶Neutrase 0.8L直接水解草魚皮制備得到富含膠原蛋白肽的蛋白水解物，不僅可以省略提取膠原蛋白或明膠步驟，提高草魚皮蛋白利用率和簡化工藝，而且含有寡肽和氨基酸的蛋白水解物對嗜熱鏈球菌增殖具有促進作用，是一種培養(yǎng)嗜熱鏈球菌的理想氮源。

嗜熱鏈球菌培養(yǎng)的最佳氮源是寡肽，下一步主要研究不同分子質(zhì)量區(qū)間的肽對嗜熱鏈球菌的增殖效果，并且在最佳的分子質(zhì)量區(qū)間內(nèi)嘗試找到起增殖效果的目標肽。為魚皮膠原蛋白肽應用到微生態(tài)領(lǐng)域，發(fā)揮其營養(yǎng)和功能特性，提供進一步的實驗依據(jù)。

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Enzymatic Preparation of Protein Hydrolysate from Grass Carp Skin for Use as a Nitrogen Source for Streptococcus thermophilus Growth

CHEN Jiankang,BAO Jianqiang*
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation,College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Abstract:Streptococcus thermophilus is regarded as a multi-functional probiotic bacterium.Five protein hydrolysates from grass carp skin were prepared using Neutrase 0.8L,Protease P “Amano” 6,ProteAX,Alcalase 2.4L FG and Flavourzyme,respectively,for use as nitrogen sources to culture Streptococcus thermophilus.Among the five proteases,Neutrase 0.8L was found to be the best enzyme to produce the optimal nitrogen source for the growth of Streptococcus thermophilus.In further investigations,we optimized hydrolysis conditions using orthogonal array experiments.The results showed that the optimal hydrolysis conditions were as follows:e nzyme dosage,1%; hydrolysis time,80 min; initial pH,6.5; and ratio between fresh skin and water,1:2(m/V).The hydrolysate obtained under these conditions was rich in collagen-derived peptides as a new optimum nitrogen source for Streptococcus thermophilus incubation.

Key words:grass carp skin; protease; hydrolysis; collagen-derived peptide; Streptococcus thermophilus

中圖分類號：TS254.1；TS254.9

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0144-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605026 10.7506/spkx1002-6630-201605026.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：包建強（1963—），男，教授，碩士，研究方向為食品冷凍。E-mail：baojq@shou.edu.cn

作者簡介：陳建康（1973—），男，工程師，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：jkchen@shou.edu.cn

基金項目：上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）

收稿日期：2015-04-07